原位膀胱癌动物模型建立的研究进展及应用展望

付阳，熊轶，张古田

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.南京鼓楼医院 泌尿外科，江苏 南京 210008)

·综 述·

原位膀胱癌动物模型建立的研究进展及应用展望

付阳1，熊轶1，张古田2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.南京鼓楼医院 泌尿外科，江苏 南京 210008)

建立原位膀胱癌动物模型的方法很多，最早使用化学诱癌剂致癌，目前最常使用细胞或组织原位移植技术，基因工程技术尚不成熟。深刻理解动物模型建立的方法有助于探究膀胱癌发生发展的分子机制及更好地评价新型靶向药物的功效。作者对常用的建立原位膀胱癌动物模型的具体方法步骤、各自特点作一综述并展望其应用。

动物模型； 膀胱癌； 研究进展； 展望； 文献综述

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率及病死率均列泌尿生殖系统肿瘤的首位[1]。表浅性的膀胱癌，首选经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)治疗辅助术后膀胱灌注化疗药物。由于新发肿瘤、肿瘤细胞种植于手术创面或者原发肿瘤切除不完全，TURBT术后肿瘤复发率居高不下，因此迫切需要开发新型的术后辅助治疗方法。早期的肿瘤研究多采用体外细胞实验，但其具有相当的局限性，比如肿瘤细胞生长的环境异于原位肿瘤、缺少肿瘤生长及发展的多向性、缺少血管化及血管灌流、缺少免疫反应的干预、培养基多包含人工的生长因子和激素。动物实验是细胞实验和临床实验之间的重要桥梁，在特定条件下，动物疾病的发生发展与人类相似，且动物拥有与人类相似的解剖、生理及遗传，因此动物模型常被用来研究人类疾病。原位膀胱癌的动物模型可用来研究人类膀胱癌疾病的病因、病理改变及相关生物学行为，也是进行新型抗膀胱癌药物、给药方式实验的基础。

1 化学致癌剂诱导模型

1944年有研究[2]首次报道使用二乙基氨基芴(AAF)成功诱导鼠的膀胱乳头状瘤模型。AAF是一个多能致癌物，也可以诱导其他器官的肿瘤，包括肝脏、胰腺、乳腺、皮肤等。以后发现许多化学物质可以成功诱导实验动物的原位膀胱癌模型。但因为诱导肿瘤的周期过长、肿瘤诱发率过低、本身毒性作用太强及器官特异性较差等因素，大部分化学致癌剂的效果并不能使人满意，这限制了该种方法的广泛使用。目前效果理想的致癌剂仍只有N-methyl-N-nitrosourea(MNU)、N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine(BBN)等亚硝基类化合物和N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl] formamide(FANFT)等硝基呋喃类化合物两大类。

1.1 膀胱灌注MNU诱导原位膀胱癌模型

MNU为直接诱癌剂，在动物体内主要通过细胞大分子比如鸟嘌呤等发生甲基化作用，可以对很多脏器产生致癌活性，并且呈现出渐进的致癌动态过程。Hicks等于1972年首次报道分次膀胱灌注MNU溶液可以快速诱导大鼠的原位膀胱肿瘤[3]，此后国内外建立原位膀胱癌模型大多采用多次定量膀胱灌注MNU溶液的方法[4-5]。各种规格的MUN可以由医药公司直接购得，刘红耀等[6]曾使用甲胺、尿素、亚硝酸钠及浓酸等化学试剂自制MNU并成功诱导大鼠原位膀胱癌模型；配制溶液的溶剂多选用pH 6.0的缓冲液，在此pH值下MNU的半衰期最长，可使其作用于膀胱时间最大化以增强诱发膀胱癌的效果；实验动物一般选用6～10周雌性大鼠，由于其生理解剖特点，方便经尿道插入导管进入膀胱并灌注MNU溶液；导尿器材采用长约5 cm的硬膜外导管即可；采用膀胱灌注MUN建模，用量多为每次2 mg或2.5 mg，每两周1次，灌注2～4次，开始膀胱灌注后7周，病理检查即出现原位膀胱癌改变，9周左右其致癌率可达100%[7]；研究表明,分次定量灌注MUN，其诱癌率与灌注MNU总量及膀胱灌注次数呈正相关，诱癌需时与膀胱灌注MNU 的总量呈负相关。该方法特点主要有：(1) 膀胱灌注MUN用量相对偏少且比口服给药精确；(2) 操作相对方便，只需行膀胱灌注数次便可诱导原位膀胱癌，用时相对短；(3) 其诱导的原位膀胱癌与人类膀胱癌的发生、发展及生物学行为相似，病理学上多为尿路上皮癌；(4) 加用表皮生长因子、菲那西丁、糖精等促癌剂可明显缩短诱癌时间；(5) 联合应用BBN等其他诱癌剂可明显增强MNU的诱癌活性；(6) MNU的本身毒性容易导致实验动物的死亡，实验过程的死亡率可达10%～40%。

1.2 经口给药BBN或FANFT诱导原位膀胱癌模型

BBN及FANFT均属间接诱癌剂，BBN多数混入饮水、FANFT常混入日常饮食给药。目前BBN是诱导动物膀胱癌最常使用的化学致癌剂，因为其诱癌效应具有膀胱特异性,可能是研究中最常应用的实验诱癌剂。BBN主要通过激活体内酶系统而发挥致癌作用，可导致组织结构和生理功能的变化，其致癌作用具有器官特异性，因为其自身及其进一步代谢产物N-butyl-N-(3-caroxypropyl，BCPN)经尿液排出，直接与尿路上皮接触，导致其发生炎症和坏死，造成尿路上皮细胞DNA损伤，从而导致尿路上皮细胞发生癌变[8]。BBN致癌的实验动物品种很有限，仅限于大鼠、狗及小鼠，其中大鼠的膀胱上皮对BBN最敏感；实验中BBN的给药方式多采用管饲灌胃法，此法简单、可靠、精确、安全，也可将BBN溶于饮水中饲养实验动物，常用浓度为0.01%～0.05%[9]；部分研究报道也可采用皮下注射、膀胱灌注方法；给药剂量多为每千克50～100 mg；研究表明与大剂量集中给药相比，小剂量多次给药的诱瘤率高、平均瘤体积大、细胞分化差、数目多、浸润率高。FANFT在体内主要通过膀胱黏膜的前列腺素H合酶共氧化作用发挥致癌效应；其致癌谱较广，常用于诱导多种动物的膀胱癌模型，啮齿类对其较敏感；给药方式多为混入食物中饲喂实验动物，常用浓度为0.2%[10]；试验中FANFT致癌花费较多，诱癌时间也长。

不管采用何种诱癌剂诱导膀胱癌，膀胱癌变均需经历一个续发的动态改变过程，且因动物品系不同而稍有变化。肉眼观察，在膀胱癌的发生过程中，可以见到大小不一的灰白色肿物随机分布于整个膀胱腔内任意处，甚至可以多发至布满膀胱腔内；大鼠膀胱癌可表现为与人类病变相似的带蒂的菜花样肿物，伴区域坏死、出血、溃疡等。小鼠膀胱癌镜下常显示经历上皮异型增生、原位癌、浸润性癌的过程；而大鼠则为单纯性增生、发展为乳头状或结节性增生、乳头瘤、低度恶性的乳头状瘤、低级别乳头状癌、高级别乳头状癌和浸润性癌的动态过程。相比于小鼠，大鼠膀胱肿瘤更易表现为乳头状癌。这提醒我们研究中不仅需要选择诱癌方式，也需要根据诱癌要求选择合适的动物品系。

2 基因工程模型

目前除采用化学试剂诱导原位膀胱癌动物模型，已有研究开始使用转基因动物来建立膀胱癌动物模型。当前已被研究证实的膀胱癌的相关基因主要有RB1、Ha-ras、CK19-Tag、Nrf2、P53、Pten、Hras 128、p27和UPⅡ-SV407；膀胱上皮的致癌基因Ha-ras等的激活或抑癌基因RB1和p53的沉默甚至修改考虑与膀胱尿路上皮癌的发生相关[11-12]。随着膀胱癌相关分子机制的逐渐明了和分子生物学技术的逐渐成熟，人们成功建立了转基因动物模型，其可以更好地在分子水平再现人类膀胱癌的生物学行为。建立转基因动物模型的方法主要包括显微注射法、精子载体法、逆转录病毒感染法和胚胎干细胞介导法，其中以显微注射法最为成熟。将纯化的目的基因片段显微镜下注射入受精卵，该目的基因片段可整合至实验动物染色体中，随着胚胎发育而分布于实验对象每一个体细胞中，建立膀胱原位癌模型的基础是该目的基因可以特异性表达于不同组织和器官。一项研究表明，缺乏pRB和p53表达的小鼠极易受到致癌物质的影响，并最终表现出与人类膀胱癌相似的膀胱浸润性癌[13]。转基因动物模型提供了一个研究膀胱癌癌变过程分子机制及评价潜在新药和治疗方式的理想体系，但其有技术复杂，费用高昂、基因外显率低、建模成功率低、缺少预测肿瘤发展的标准模式等问题，利用外源癌基因或其相关激活基因转染建立模型会简化操作步骤，因此利用基因转染技术来建立原位膀胱癌模型成为新的研究热点；特定基因的敲除、沉默或者置换可以研究该基因片段在癌变过程中的相关作用。基因工程模型的局限性也是显而易见的，实验动物发生的膀胱癌往往较单一，而人类膀胱癌是多样化的。

3 原位膀胱癌移植模型

膀胱内移植膀胱癌细胞或组织碎片是目前最广泛采用的原位膀胱癌建模的方法，根据使用的细胞株或组织块的来源可分为同种移植和异种移植。常用的细胞株有MB49和MBT-2[14]，利用两种细胞株建立原位膀胱癌模型的成功率可达30%～100%[15]；移植模型建立的成功率与癌细胞预处理的方法、癌细胞数量和分化程度有关。成功研制出免疫缺陷鼠大大提高了异种移植的成功率，该建模方法可以采用人源膀胱癌细胞或者膀胱癌组织来建模，这是化学制剂建模方法无法达到的；但实验对象先天性的免疫缺陷也导致该移植模型不能进行原位膀胱癌免疫应答的相关实验研究。移植模型的方便实用及优越性已经得到大家的肯定，目前研究热点主要集中在怎么改进移植方法以提高建模的成功率。

早期多采用直接向膀胱内灌入膀胱癌细胞或组织碎片的方法，操作步骤与膀胱灌注MNU相似，是经尿道将导管插入实验对象的膀胱，再向膀胱内灌入膀胱癌单细胞悬液以建立原位膀胱癌的动物模型，解剖学上的差异致使该技术较难在雄性动物上实施，目前实验室多采用易于操作的雌性动物。异种移植采用的人源膀胱癌细胞有KK47、KU7、T24及UM-UC1等[16-17]。相关研究认为仅仅增加灌入膀胱的肿瘤细胞数量并不增加膀胱内灌注建模的成功率，其成功率还受到悬液的菌体浓度、灌入悬液的体积及悬液与膀胱黏膜接触时间的影响。有研究表明适当延长灌入悬液于膀胱的停留时间可以提高建模的成功率[18]；有报道对膀胱灌注法加以改进，膀胱灌注膀胱癌单细胞悬液后夹闭导管直至实验对象清醒，该法可防止麻醉期间灌入实验对象膀胱的膀胱癌单细胞悬液外流，延长膀胱癌细胞与实验对象膀胱黏膜的接触时间，发病率可达100% ，是一种更为方便、简单、有效的建模方法。

完整膀胱黏膜表面覆盖着一层氨基葡聚糖，可保护膀胱黏膜免受移植的肿瘤细胞侵袭，降低了建模的成功率。相关研究表明，通过破坏膀胱黏膜完整性可提高建模的成功率；常采用机械损伤、强酸强碱腐蚀作用及高温高热破坏膀胱黏膜后再进行膀胱癌细胞或组织的移植。早期大多采用开放手术暴露实验对象的膀胱，使用注射器将膀胱肿瘤单细胞悬液直接注入黏膜下层完成移植；此法建立的模型肿瘤局限于黏膜下层，减少了发生上尿路感染和膀胱癌细胞的逆行种植的几率，有术中出血、术后感染和癌细胞种植于手术区域的可能。Yang等[19]报道一种机械损伤后再建模的新方法，其使用静脉留置针自制成内有弯曲针芯的导管，将该导管经尿道置入膀胱，进入膀胱后慢慢旋转针芯损伤膀胱黏膜，抽出针芯，从导管末端向膀胱内灌入膀胱肿瘤单细胞悬液以建立模型，诱发膀胱内肿瘤所需时间27 d左右，建立原位癌模型成功率高达100%；该方法不需繁琐的手术操作，对膀胱损伤较小且易重复，具有很强的实用性。Dobek等自制带有绝缘导管的铂丝，经尿道置入膀胱内，使用电流造成膀胱的电热损伤，再灌入膀胱癌单细胞的悬液并保留至少90 min，允许悬液的自然流失，膀胱成瘤率高达100%且无膀胱穿孔发生；该法简单、方便、可重复，操作器械要求较高，有膀胱穿孔的可能性[20]。其它的膀胱预处理方法还包括强酸、强碱、胰蛋白酶及多聚赖氨酸等[21-23]；Watanabe[21]等报道首先使用0.1 ml的0.2%浓度胰蛋白酶灌入膀胱并保留30 min，机械性损伤膀胱黏膜后缓慢灌入膀胱肿瘤单细胞悬液且持续3 h；10 d后显微镜镜检膀胱成瘤率高达90%，但操作有关的死亡率高达30%。该法成瘤迅速、操作简单方便，但实验过程中死亡率偏高。

4 原位膀胱癌动物模型用于新型靶向药物功效评价

过去的几十年间，大量的研究采用组织病理学、免疫组化、影像分析、基因分析及基因测序分析发现了人类和啮齿类动物膀胱癌的大量相似之处[24]。Lu及其团队[25]使用啮齿类动物膀胱癌模型，发现目标基因与临床表现的精确对应关系，且研究者还发现这些基因在人类膀胱癌中也是异常表达的。其中CNN1、MYL9、PDLIM3、ITIH5、MYH11、PCP4和FM05是显著下调表达的，而T0P2A、CCNB2、KIF20A和RRM2则是显著上调的；这些基因的异变有可能促进膀胱的癌变。基因集合分析发现在人类或者啮齿类动物的膀胱癌中，一些分子信号通路均处于激活状态。这些分子信号通路可影响细胞周期、原癌基因、细胞凋亡和细胞自噬等。以往的癌症疗法均是基于采用药物影响细胞分裂，但这些药物也会影响到正常细胞的分裂且其或多或少具有一定的毒副作用。现在发现，识别某些信号通路如FGFR3、RAS和PIK3CA等，也可抑制癌细胞增殖及致死肿瘤细胞；最关键为这些靶向药物可以仅仅针对膀胱癌细胞，对正常细胞的影响微乎其微。

总而言之，建立原位膀胱癌动物模型已经有了许多可行、有效、可重复的方法，熟悉各方法的优缺点及适用范围，可帮助选择有效、适当的方法完成实验研究。随着膀胱癌分子机制的逐渐明确，原位膀胱癌模型也会更多地应用于新型靶向药物的功效评价。

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2015-04-28

2015-05-12

江苏省人事厅六大人才高峰项目(2011-WS-007)

付阳(1990-)，男，江苏淮安人，在读硕士研究生。E-mail：15952083610@163.com

张古田 E-mail:zgt6810@aliyun.com

付阳，熊轶，张古田.原位膀胱癌动物模型建立的研究进展及应用展望[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：832-835．

R-332; R737.14

A

1671-6264(2015)05-0832-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.034