Cox-2、nm23和MMP-3在直肠小细胞癌中的表达及临床意义

张剑虹　张飞　张晓丽　孙忠哲

Cox-2、nm23和MMP-3在直肠小细胞癌中的表达及临床意义

张剑虹张飞张晓丽孙忠哲

【摘要】目的探讨直肠小细胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表达及与临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学方法及组织芯片技术，观察63例直肠小细胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表达情况。结果Cox-2、MMP-3阳性表达率与直肠小细胞癌的浸润深度、肠系膜淋巴结转移有关，随浸润深度加深，淋巴结转移率增加而升高( P＜0．05)。Cox-2、MMP-3阳性表达率与直肠小细胞癌的TNM分期无关( P＞0．05)，nm23蛋白的阳性表达与肠系膜淋巴结转移，TNM分期有关，随淋巴结转移，TNM分期的增加而减低( P＜0．05)，与浸润深度无关( P＞0．05)。Cox-2、nm23和MMP-3的表达与患者年龄、性别无关( P＞0．05)。结论直肠小细胞癌的nm23、Cox-2和MMP-3的表达与临床预后密切相关，联合检测可预测直肠小细胞癌的恶性程度及判断预后。

【关键词】环氧合酶;基质金属蛋白酶;组织芯片;免疫组化;直肠小细胞癌

直肠小细胞癌恶性度高，侵袭性强，常侵达壁浆膜外及远隔器官，其转移机制不清，癌细胞的侵袭性与新血管的生成，细胞外基质降解等因素密切相关。环氧合酶( Cox-2)在细胞的凋亡和肿瘤发生中起一定作用;肿瘤抑制基因( nm23)与多种恶性肿瘤的浸润和转移有关;基质金属蛋白酶( MMP-3)通过参与降解细胞外基质和基底膜参与直肠小细胞癌的发生，发展。本实验应用免疫组织化学方法及组织芯片技术，观察Cox-2、nm23和MMP-3在63例直肠小细胞癌中表达，研究癌细胞的浸润，转移分子机制，为临床治疗提供相关依据。

1　资料与方法

1．1一般资料选取河北北方学院附属第一医院

2010年1月至2012年10月手术后经病理诊断为直肠小细胞癌标本63例，其中男28例，女35例;年龄34～75岁，平均54．5岁;≥50岁41例，＜50岁22例;浸润深度未侵及浆膜26例，侵及浆膜37例;有肠系膜淋巴结转移33例，无肠系膜淋巴结转移30例;按TNM标准分类，Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期36例，所有病例均无手术断端肿瘤残留。

1．2标本处理及诊断所有标本术前均未进行化疗、放疗及免役治疗，手术切除新鲜直肠小细胞癌标本，经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm厚连续切片，两位有经验病理医师显微镜下诊断为黏液腺癌。

1．3组织芯片制备组织芯片委托试剂公司在天津肿瘤医院肿瘤研究所完成，过程如下:组织载玻片经过夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚赖氨酸行防脱片处

理，对每一组织标本，观察HE切片，选取目标组织并在HE切片及其相应石蜡组织块(供体蜡块)上标记，莱卡石蜡空白蜡块(受体蜡块)与蜂蜡混合(比例为1∶1)，制成2．2 cm×3．5 cm×1 cm大小蜡块，用加拿大生产CDX718组织芯片仪打孔制成带孔空白蜡块，将蜡块放在39～42℃水浴中软化后，用组织芯片仪从供体蜡块标记部位逐个取出直径1 mm高4 mm的组织柱，推入空白蜡块预先设计的相应孔内，这样在空白蜡块上制作完成了68个组织芯片，为防止染色过程中脱片，每例标本上样四个点，分别安插在空白蜡块1和2中，对蜡块进行连续切片，裱于防脱片处理的载玻片上。

1．4免疫组织化学染色nm23、Cox-2、MMP-3抗体浓缩液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按不同比例稀释后进行预实验，选择最佳稀释比例。应用免疫组化S-P法进行，实验过程均由同一病理技师操作完成，梁色步骤:石蜡切片常规脱蜡，水化，加3%过氧化氢甲醇溶液50 μl，阻断过氧化物酶后，加热修复抗原10 min，加10%正常山羊血清封闭，室温温育10 min，加第一抗体，室温温育120 min，加生物素标记的第二抗体50 μl，室温温育10 min，加辣根酶标记的链酶卵白素溶液50 μl，，室温温育10 min，加新鲜配制DAB溶液100 μl显色。以上各步骤之间均用缓冲液冲洗3次，共15 min，苏术精对比染色、脱水、透明、封固，镜下观察。

1．5阳性判断标准阳性结果判断根据以下两方面的总分进行判断: ( 1)选染色均匀的阳性表达区域，5个高倍视野计数阳性细胞，以阳性细胞所占百分比为5级计分:阳性细胞率＜5%为0分;阳性细胞率5%～25%为1分;阳性细胞率26%～50%为2分;阳性细胞率51%～75%为3分，阳性细胞率＞75%为4分。( 2)按染色强度来分:不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。两种评分相加，0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性( + )，4～5分为阳性( + + )，6～7分为强阳性( + + + )，以上方法均由2名有经验的高年资病理医师采用双盲法独立检测，取平均值。Cox-2的表达以细胞质和(或)细胞膜出血棕黄色颗粒为阳性，MMP-3的表达以细胞核出现棕色为阳性。光镜下随机计数5个高倍视野，当阳性染色癌细胞≤25%定为阴性表达，＞25%定为阳性表达。

1．6统计学分析应用SPSS 6．12统计软件，计数资料采用χ2检验和线性相关分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1Cox-2在直肠小细胞癌组织中的表达与临床病理特征的关系在直肠小细胞癌组织中表达的阳性率为57．14%( 36/63)，分布特点: Cox-2阳性细胞可见细胞浆内浅-棕黄色颗粒，密度较均匀，与血管走行无规律性。Cox-2阳性在直肠小细胞癌侵及浆膜和未见侵及浆膜2组间比较(χ2= 6．31，P＜0．05) ;肠系膜淋巴结转移和未见转移2组间比较(χ2= 9．81，P＜0．05)。Cox-2阳性表达率随直肠小细胞癌浸润深度，淋巴结转移增加而升高。Cox-2在直肠小细胞癌中阳性表达与TNM分期无相关性( P＞0．05)。见表1、图1。

2．2nm23在直肠小细胞癌组织中的表达与临床病理特征的关系nm23在直肠小细胞癌组织中阳性表达率为49．21%( 31/63)，分布特点: nm23阳性细胞可见细胞浆浅-黄色颗粒，与血管走行无规律性，密度分布不均匀。nm23阳性率在肠系膜淋巴结转移和未见转移2组间比较(χ2=6．99，P＜0．05)，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期与Ⅰ+Ⅱ期组间比较(χ2= 8．47，P＜0．05)。nm23阳性率随淋巴结转移，TNM分期的增加而降低。nm23阳性率与浸润深度无相关性( P＞0．05)。见表1，图2。

2．3MMP-3在直肠小细胞癌组织中的表达与临床病理特征的关系MMP-3在直肠小细胞癌组织中表达的阳性率为61．90% ( 39/63)，分布特点: MMP-3阳性细胞可见细胞浆浅-黄色颗粒，与血管走行无规律性，密度分布较均匀。MMP-3侵及浆膜和未见侵及浆膜2组间比较(χ2= 6．02，P＜0．05) ;肠系膜淋巴结转移和未见转移2组间比较(χ2=5．64，P＜0．05)。MMP-3阳性表达随浸润深度，淋巴结转移增加而升高。MMP-3阳性表达与TNM分期无相关性( P＞0．05)。见表1，图3。

2．4Cox-2、nm23、MMP-3的阳性表达率与直肠小细胞癌患者的年龄，性别的关系Cox-2、nm23、MMP-3的阳性表达率与直肠小细胞癌患者的年龄、性别的关系无关( P＞0．05)。见表1。

3　讨论

直肠小细胞癌恶性度高，容易局部侵袭，淋巴道扩散及远处转移，患者预后差，探索其转移机制十分必要。肿瘤较强的增殖，侵袭特性与肿瘤细胞分裂旺盛，细胞间黏附力改变，降解基质及微血管新生等因素有关。本实验分别研究Cox-2、nm23和MMP-3与直肠小细胞癌的生物学行为的相关性。

环氧合酶( cyclooxygenase，COX)又称为环氧化酶和PG内过氧化物合成酶。是催化花生四烯酸转化为前列腺素( PG)合成过程中的一个关键限速酶。高含

量的PG可加速肿瘤组织增值、侵袭、转移。Cox-2可通过刺激肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，抑制细胞免役功能等促进癌前病变向肿瘤转化，可以通过促进脉管形成参与浸润，转移。Cox-2可通过诱导血管内皮生长因子的表达来增加肿瘤血管的生成，生长，侵袭。Cox-2在细胞的凋亡和肿瘤发生中起一定作用。近年发现多器官恶性肿瘤均有Cox-2的高表达。罗琼等［1］发现Cox-2在卵巢癌中的表达明显高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织，并与淋巴结转移有关。张帅等［2］发现具有淋巴结转移的甲状腺癌的Cox-2表达显著高于无淋巴结转移的癌组织。本研究检测了63例直肠小细胞癌Cox-2的表达，发现浸润至浆膜层的Cox-2表达率为70．27%，与未浸润至浆膜组的病例相比( 38．46%)，差异有统计学意义( P＜0．05) ;有淋巴结转移组Cox-2表达率为75．76%，显著高于无淋巴结转移组( 36．67%)，差异亦有统计学意义( P＜0．05)。显示Cox-2高表达的病例肿瘤细胞生长快，不易凋亡，Cox-2通过诱导肠壁肌层-浆膜层等肿瘤内小血管的新生，使癌细胞容易浸润。Cox-2蛋白的高表达可促进癌组织的快速增殖，向远隔器官的播散及淋巴道的转移，Cox-2可作为预后不良的参考因素。

图1　直肠小细胞癌的Cox-2的表达( SP× 200)

图2　直肠小细胞癌的nm23的表达( SP× 200)

图3　直肠小细胞癌的MMP-3的表达( SP× 200)

表1　Cox-2、nm23、MMP-3在直肠小细胞癌组织中的

nm23基因是近年来发现并被证实与多种肿瘤转移有关的肿瘤抑制基因，现已检测出三种亚型: nm232H1、nm232H2、nm232H3。主要是nm232H1发挥作用，其表达与多种恶性肿瘤的浸润和转移有关。nm23的作用机制包括:作为一种分泌蛋白，具有细胞因子的功能，介导细胞吞噬功能及运动活性，并调节细胞正常发育和分化。nm23的同源基因awd参与CTP激活蛋白的作用，awd的突变或表达下调可导致异常分化，广泛畸形及癌变，甚至在前蛹期死亡［3］。高艳等［4］发现随结肠癌浸润的加深，其阳性表达逐渐降低，有淋巴结转移者的阳性表达较无淋巴结转移者显著降低。本研究中我们检测了63例直肠小细胞癌nm23的表达，淋巴结转移组nm23阳性率33．33%，低于无淋巴结转移组( 66．67%)，TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期组nm23阳性率33．33%，低于分期为Ⅰ+Ⅱ期组，差异均有统计学意义( P＜0．05)。显示nm23表达下调使正常免疫细胞对机体免疫调节功能减低，使失去调节的癌细胞生长旺盛，具备了更强的侵袭和转移能力，同时nm23的同源基因awd激活了CTP蛋白，使直肠正常细胞癌变数量增多，广泛癌变细胞无限制生长，侵犯周围肠壁血管，肌纤维及淋巴结。nm23表达率越低，其淋巴结转移率越高，TNM分期越高。nm23在直肠小细胞癌转移中发挥负性调节作用。

基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)是一组锌离子依赖性内肽酶，可以降解不同的细胞外基质［5］。MMP-3是MMP-s的一员，是人体内降解ECM的主要酶类，MMP-3通过参与降解细胞外基质和基底膜，并激活与肿瘤浸润和转移有关的其他MMP-s、N-cadherin等参与癌肿的发生、发展。于秀文等［6］发现结肠癌中MMP-3的表达增加，MMP-3与结肠癌分化程度，浸润深度无关，而与淋巴结转移呈正相关。本研究发现MMP-3在直肠小细胞癌中高表达，浸润至浆膜层的MMP-3表达率为62．16%，与未浸润至

浆膜层的病例相比( 30．76%)，差异有统计学意义( P ＜0．05) ;有淋巴结转移的病例其阳性率为67．56%，与无淋巴结转移组相比( 46．67%)，差异亦有统计学意义( P＜0．05)。显示MMP-3表达越高，越容易激活与直肠小细胞癌浸润和转移有关的其他MMP-s、N-cadherin等，使癌细胞越容易侵及浆膜和淋巴道扩散。MMP-3通过降解直肠小细胞癌细胞外基质和基底膜，使癌细胞黏附力减低，使癌肿更容易生长，转移。这些都提示MMP-3参与的直肠小细胞癌的发展，在肿瘤的侵袭和转移过程中起重要作用，MMP-3可作为判断直肠小细胞癌预后的指标。

从Cox-2、nm23和MMP-3蛋白在直肠小细胞癌的表达，说明它们都参与了直肠小细胞癌的局部侵袭和远处播散，它们是否在直肠小细胞癌的远处转移中起协同作用以及相互作用机制还需进一步研究。总之检测Cox-2、nm23和MMP-3的表达可以判断直肠小细胞癌患者的预后。

参考文献

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2张帅，沈梁，谷维立，等．VEGF，COX-2在甲状腺癌中的表达及临床意义．医学研究杂志，2012，41: 146-150．

3张汉群，鲁亮，张芸，等．ERCC1、nm23-H1在大肠癌组织中的表达及临床意义．广东医学，2011，32: 2555-2559．

4高艳，张险峰．c-erbB-2，bcl-2和nm23蛋白在结肠癌组织中的表达及意义．黄石理工学院学报，2011，27: 51-54．

5Singh B，Berry JA，Shoher A，et al．COX-2 overexpression increases motility and invasion of breast cancer cells．Int J Oncol，2005，26: 1393-1399．6于秀文，程慧，王静芬．粘蛋白MUC1，MUC2及基质金属蛋白酶MMP-3在大肠癌中的联合表达及临床意义．医学研究杂志，2008，37: 23-27．

·论著·

作者单位: 075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院病理科(张剑虹、孙忠哲)，放疗科(张飞) ;河北北方学院(张晓丽)

Expression and clinical significance of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum

ZHANG Jianhong*，ZHANG Fei，ZHANG Xiaoli，et al．*Department of Pathology，The First Hospital Affiliated to Hebei North University，Hebei，Zhangjiaku 075000，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between expression of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of the rectum and clinicopathological characteristics．Methods The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 in 63 cases of small cell carcinoma of rectum were detected by immunohistochemistry and tissue microarray technology．Results The positive expression rates of Cox-2，and MMP-3 were correlated to mesenteric lymph node metastasis and depth of tumor invasion，with the increase of infiltration depth of tumor，lymph node metastasis rate was increased ( P＜0．05)．The positive expression rates of Cox-2 and MMP-3 were not correlated to TNM staging ( P＞0．05)．However positive expression of nm23 protein was related with mesenteric lymph node metastasis and TNM staging ( P＜0．05)，with lymph node metastasis and increase of TNM stage，which was decreased ( P＜0．05)，however，which was not related to infiltration depth of tumor ( P＞0．05)．The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 were not correlated to patient＇s age and sex ( P＞0．05)．Conclusion The expression levels of Nm23，Cox-2 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum are closely related to clinical prognosis，and combined detection can predict the malignant degree of tumor and can evaluate patient’s prognosis．

【Key words】cyclooxygenase; matrix metalloproteinases; tissue microarray technology; immunohistochemistry; samall cell carcinoma of the rectum

收稿日期:( 2014－07－11)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．005

【中图分类号】R 735．37

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386( 2015) 04－0497－04