膜型基质金属蛋白酶—1表达对肝细胞癌血管生成拟态形成的影响

程锐等

[摘要] 目的 研究膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）表达对肝细胞癌血管生成拟态（VM）形成的影响及机制。 方法 构建靶向MT1-MMP的RNA干扰质粒载体，转染肝癌细胞系Bel7402，实时定量PCR及Western blot检测干扰效果；在体外三维细胞培养体系中观察其对VM管状结构形成的影响；Transell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力。 结果 靶向抑制MT1-MMP的表达下调肿瘤细胞侵袭能力，影响肝癌细胞在三维细胞培养体系中VM管状结构的形成。 结论 MT1-MMP表达影响肝细胞癌VM的形成，可能成为肝细胞癌抗血管生成治疗的新靶点。

[关键词] 肝细胞癌；基质金属蛋白酶；血管生成拟态；RNA干扰

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（c）-0013-04

Eeffects of expression of membrane-type 1 matrix metalloproteinase on vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma

CHENG Rui CAI Xinran ZHOU Haohui KE Kun CHEN Yanling

Department of Hepatobiliary Surgery， Union Hospital Affiliated to Fujian Medical College， Fujian Province， Fuzhou 350001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of MT1-MMP on vasculogenic mimicry （VM） formation in hepatocellular carcinoma （HCC） and discuss its possible mechanisms. Methods RNA interfere plasmid targeting MT1-MMP was constructed and transfected into a HCC cell lines. Interference effect was detected by real time PCR and Western blot. VM networks in 3D cell culture system were observed with a microscope. Cell invasion assay was performed using 24-well transwell. Results Inhibition of MT1-MMP expression impaired VM network formation in vitro by down-regulating cell invasion. Conclusion MT1-MMP influences vasculogenic mimicry formation in HCC cell line and offers a potential molecular target for HCC antiangiogenesis therapy.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Matrix metalloproteinase； Vasculogenic mimicry； RNAi

1999年Maniotis等[1]在对眼葡萄膜色素瘤及转移性皮肤黑色素瘤的研究中发现一种无内皮细胞参与，由肿瘤细胞排列形成的管道结构，血管造影证实其参与肿瘤的血液供应。他们将这种血管样结构命名为血管生成拟态（vculogenic mimicry，VM）。VM合理的解释了目前针对内皮细胞的抗血管生成药物实际疗效与预期存在较大差距的原因，对经典的抗肿瘤血管生成治疗理论提出了挑战[2]。后续的研究证实VM存在于多种高侵袭性的肿瘤，且存在VM的患者预后不佳[3-5]。原发性肝细胞癌是一种恶性程度、侵袭性高的实体肿瘤，手术切除后复发率高，预后较差[6-7]。肝细胞癌中VM的存在已被证实[8-10]。但目前肝细胞癌VM形成机制及治疗靶点的研究仍处于起步阶段。本研究拟探讨膜型基金属蛋白酶（MT1-MMP）表达对肝细胞癌VM生成的影响，为肝细胞癌抗血管生成治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

Bel 7402肝癌细胞系购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；兔抗人MT1-MMP抗体购于英国Abcam公司；胎牛血清、DMEM培养基、PCR 引物、Trizol RNA提取试剂、逆转录试剂盒、Lipofectamine 2000TM脂质体、质粒抽提试剂盒购于美国Invitrogen公司；易必迪血管生成板（IBIDITM μ-slide）购于德国Ibidi公司；基质胶购于美国Corning公司Tanswell侵袭小室购于美国Millipore公司；蛋白抽提试剂盒购于杭州碧云天生物科技有限公司；羊抗兔二抗、BCA蛋白定量试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 MT1-MMP的siRNA质粒的构建

根据RNA干扰序列设计原则，设计2条靶向MT1-MMP基因的RNA干扰靶点序列分别为ATCACTT-TCTGCATCCAGA和GTACTACCGTTTCAACGAA。合成含干扰序列的DNA双链，酶切后连接入同一真核质粒载体pGenesil 1.2中。连接产物转化感受态细胞，所获克隆行PCR鉴定。

1.3 细胞转染及MT1-MMP表达的检测

Bel7402细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，置于37℃含5%CO2的温箱中。细胞分为两组：siRNA组使用RNA干扰质粒载体进行转染；阴性对照组使用阴性对照质粒转染；使用Lipofectamine 2000TM脂质体进行质粒转染。转染24 h后，消化贴壁生长的Bel7402细胞，1000 r/min离心5 min， 离心半径为13.5 cm。收集细胞，PBS 洗涤两次，转移至EP管中，5000 r/min离心1 min，弃去上清。使用Trizol抽提总mRNA，按说明书使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA分子。根据PCR引物设计的原则，软件设计 PCR引物：上游5′-CTGCCTACCGACAAGATTGATG-3′；下游 5′-TCCCTTCCCAGACTT-TGATGTT-3′实时荧光定量PCR检测各组细胞中MT1-MMP mRNA表达，磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参，每个样本做3个复孔。结果采用2-△△CT法分析。

按蛋白抽提试剂盒说明书操作，抽提各组细胞的总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，经含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭后，与兔抗人MT1-MMP抗体作用，二抗标记后进行显色。用凝胶图象分析系统处理胶片，采用Image J软件进行相对定量分析。GAPDH作为内参，每个样本做3个复孔。

1.4 三维细胞培养

向IBIDITM μ-slide血管生成板中加入基质胶，每孔加入10 μL，置于37℃静置30 min待基质胶塑形。收集转染24 h后的细胞、制成细胞悬液，以2×105 个/孔的浓度加入到基质胶表面，37℃培养48 h。显微镜观察VM管状结构的形成情况。Transwell侵袭实验检测体外细胞侵袭力用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。然后将小室放入培养板中，在上室加入100 μL预温的无血清培养基，室温下静置30 min，使基质胶水化。转染后的细胞用PBS清洗2次，然后用含BSA的无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×105/mL，取细胞悬液100 μL加入Transwell小室，接着向24孔板下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃ 5% CO2的培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉签擦去上室内的细胞；用甲醛固定细胞，后用0.1%结晶紫染色；400倍光镜下随机计数10个视野内的细胞数，取穿膜平均细胞数值表示肿瘤细胞侵袭能力，并进行统计处理。实验重复3 次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建并转染靶向MT1-MMP基因的siRNA质粒载体

使用质粒抽提试剂盒抽提质粒后，用限制性内切酶酶切后行电泳检测并测序，结果显示酶切片段大小正确，构建成功。见图1。

1：靶向膜型基质金属蛋白酶-1的干扰序列PCR产物；2：质粒载体；DL2000 Marker（从左往右）：100、250、500、750、1000、2000 bp

图1 构建的RNA干扰质粒载体用Hind Ⅲ+EcoRⅠ酶切后电泳图

2.2 siRNA质粒转染抑制MT1-MMP表达

使用Lipofectamine 2000TM脂质体，将抽提获得的siRNA质粒载体转染Bel7402肝癌细胞系，荧光显微镜下观察可见细胞有荧光报告基因的表达（图2，封三），表明转染获得成功。质粒转染24 h后的收集各组细胞，实时定量PCR和Western blot检测干扰后MT1-MMP的表达情况结果显示，siRNA组相对于阴性对照组，MT1-MMP基因的mRNA表达及蛋白表达均明显下调，差异有统计学意义（P < 0.05）（图3）。

2.3 三维细胞培养

在三维细胞培养体系中对各组细胞进行培养，实验结果显示，阴性对照组能形成典型的VM管腔样结构，而siRNA组细胞不能形成VM结构（图4，封三）。提示靶向抑制Bel7402细胞中MT1-MMP的表达影响其在三维细胞培养体系中VM管状结构的形成。

2.4 Transwell侵袭实验

为研究MT1-MMP表达抑制对肝癌细胞侵袭力的影响，本研究采用了Transwell侵袭实验，将两组细胞接种到Matrigel侵袭小室中，培养24 h后，对穿过Matrigel胶的细胞进行计数。结果显示，siRNA组穿膜细胞的数量较阴性对照组明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），提示MT1-MMP的下调可降低Bel7402细胞的侵袭力。见图5，封三。

3 讨论

血管生成是实体肿瘤生长的决定性因素，而抗血管生成已成为肿瘤治疗的研究热点[11]。肝细胞癌血供丰富，且恶性程度高，手术切除率低，是抗肿瘤血管生成靶向治疗的理想对象。经典的肝癌血管生成靶向治疗主要针对内皮细胞，代表药物如索拉非尼，目前已广泛应用于临床。然而这类靶向药物的实际临床疗效与预期仍有较大差距[12]。肝细胞癌中VM的发现表明这类肿瘤存在不依赖内皮细胞的其他供血方式，从而为提高靶向药物的疗效提供了新的研究方向。

目前对于肝细胞癌VM形成的机制尚不明确，研究发现可能与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）密切相关[13]。MMPs由锌离子依赖性蛋白酶组成，可以直接或间接作用于细胞外基质中的多种主要成分，并通过影响细胞黏附分子、生长因子及趋化因子等的生理功能，参与肿瘤细胞的迁移及血管生成过程，与肿瘤侵袭、转移等病理生理过程密切相关，在肿瘤发生发展过程中起着重要作用[14]。MT-MMP是MMPs的一个亚家族，现发现有6种MT-MMP。其中MT1-MMP与恶性肿瘤的侵袭行为关系密切，且在原发性肝细胞癌中高表达[15]。Hess等[16]的研究发现通过阻断磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路，抑制MT1-MMP的表达，能够减少MMP2的活化，从而减少黑色素瘤细胞血管拟态的形成。故本研究认为，在原发性肝细胞癌中，MT1-MMP表达的上调很可能是血管生成拟态形成的重要机制，而MT1-MMP极有可能成为减少肝细胞癌中血管生成拟态形成、实现抗肿瘤血管生成治疗的有效靶点。

基于以上认识，本研究构建了靶向MT1-MMP的RNA干扰质粒载体，转染至肝癌细胞株Bel7402中，该细胞株已被证实在体外三维培养体系中能够形成VM管状结构。而本实验中所使用的RNAi质粒载体是将两个作用于MT1-MMP基因不同部位mRNA的shRNA构建入同一质粒载体，每个shRNA能独立发挥RNA干扰的作用，从而更有效的实现基因沉默。实验结果显示，相对于对照组，siRNA组细胞中MT1-MMP在mRNA和蛋白水平的表达均受到明显抑制。与此同时，siRNA组细胞在三维培养体系中形成VM管状结构的能力也被抑制。此外，本研究对转染后细胞的侵袭能力及MMP2、MMP9的活性进行了检测，结果显示抑制MT1-MMP的表达下调肿瘤细胞侵袭能力，而这可能是MT1-MMP影响肝细胞癌VM形成的潜在机制。

综上所述，MT1-MMP表达能通过改变肝细胞癌细胞侵袭能力影响VM的形成，可能成为肝细胞癌抗血管生成治疗的新靶点。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-05-25 本文编辑：任 念）