牛传染性鼻气管炎病毒JZ06-8株犊牛感染模型的建立

李海涛，苗利光，朱言柱，肖佳美，刘艳环（中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112）



牛传染性鼻气管炎病毒JZ06-8株犊牛感染模型的建立

李海涛，苗利光，朱言柱，肖佳美，刘艳环＊
（中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112）

摘 要：为建立IBRV对犊牛的感染模型，将试验组第1组～3组犊牛通过鼻腔内喷雾接种4mL/头，病毒含量分别为107.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL和105.0TCID50/mL的IBRV/JZ06-8，阴性对照组同样方法接种MDBK细胞冻融物；攻毒后第0天～第14天，每天测定直肠温度，进行临床观察，采集鼻拭子进行病毒分离鉴定。结果显示，鼻内喷雾接种对犊牛可产生有效感染，106.0TCID50/mL的感染剂量即可致犊牛产生典型的IBR临床症状，并可分离到IBRV。试验成功实现IBRV/JZ06-8对犊牛的感染，该模型可用于IBRV研究和IBR疫苗评价。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；感染模型；实时荧光定量PCR

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起牛的一种接触性传染病，又称坏死性鼻炎（Necrotic rhinitis）、红鼻病（Red nose disease）。临床表现为上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等症状，还可引起生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎、流产、乳房炎等多种临床疾病［1］。本病自1955年美国首次报道以来，世界各地都相继发生和流行［2］。我国于20世纪80年代以来，先后从奶牛、水牛、黄牛、牦牛等病牛体内分离出了IBRV。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，也被我国列为二类动物传染病。本病主要感染牛，尤以肉用牛多见，其次是奶牛，肉用牛群的发病率高达75%［3-5］。研制安全有效的IBR疫苗是控制该疾病的主要方法之一。本研究用不同滴度的IBRV对犊牛进行感染，通过临床症状、生理指标变化及病毒分离鉴定等指标评价，最终成功建立了IBRV动物感染模型。为IBRV研究和IBR疫苗效力评价提供了有效的技术支持。

1　材料方法

1.1材料

1.1.1细胞和毒种 牛传染性比支气管炎IBRV/ JZ06-8株病毒，由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室分离保存；MDBK细胞购自中国兽医药品监察所。

1.1.2试验用动物和试剂 4月～6月龄健康犊牛，IBRV中和试验检测为阴性。MEM、马血清购自Gibico公司；病毒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）购自Toyobo公司。

1.2方法

1.2.1病毒制备 将超低温保存的IBRV/JZ06-8株病毒，按2.5%接种量接种到培养至单层的MDBK细胞，37℃孵育5 min～10 min，加入含20 mL/L马血清的MEM培养液，37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2d～4d，连续培养4代。

用含20mL/L马血清的MEM培养液将病毒稀释10-5～10-10倍后接种于培养至单层的MDBK细胞96孔板，37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2d～4d后观察结果，测定病毒毒价。至病毒含量大于107.0TCID50/mL后，即可做为感染毒用于感染试验。

1.2.2感染方法 将20头犊牛随机分成4组，每组5头。第1组至第3组为试验组，鼻内喷雾接种IBRV/JZ06-8，4mL/头，2mL/鼻孔，病毒含量分别为107.0TCID50/mL、106.0TCID50/mL和105.0TCID50/mL；第4组为阴性对照组，按同样方法接种MDBK细胞培养物。在牛吸气时喷入病毒液，并使牛头处于向上状态2min～5min［6］。攻毒后样品立即低温保存运回实验室回滴测定病毒毒价。

1.2.3临床检查 攻毒后第0天～第14天，每天测定直肠温度，进行临床观察，包括呼吸状况、精神状态、黏膜病变和鼻液等，并根据发病程度进行评分（无临床症状者为0分，症状严重者为满分5分）。

1.2.4病毒分离鉴定 攻毒后每天采集鼻拭子，置于含20mL/L马血清的MEM培养基中低温保存。将鼻拭子液加入培养至单层的MDBK细胞96孔板中，每个样品做复孔，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2d～4d。观察细胞病变，出现细胞病变的判定为病毒分离阳性。依照病毒DNA提取试剂盒说明书进行病毒DNA模版提取。根据文献［7-8］设计扩增片段上游引物P1：5′-GGACATGGCGGAGACGGTGGT-3′，下游引物P2：5′-CAACAAGGGCGGGGAAGCAG-3′。建立25μL实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水9.5μL；反应条件：95℃30s；95℃20s，56℃30s，72℃60s，50个循环；在72℃反应时采集荧光信号；然后采用55℃～95℃以0.5℃为1个单位采集荧光信号，制备溶解曲线。Ct＜35，曲线呈S型，认为待检IBRV样本DNA检测呈阳性（Ct越小，初始病毒量越多）［9-10］。

1.2.5分析方法 病毒含量用Reed-Muench法计算，结果用TCID50/mL表示。

2　结果

2.1病毒毒价测定结果

用于攻毒模型试验的攻击毒，病毒含量为107.39TCID50/mL。攻毒后，实验室回滴结果显示第1组至第3组病毒含量分别为106.69TCID50/mL、105.44TCID50/mL和104.39TCID50/mL。

2.2体温变化和临床观察结果

第1组犊牛在攻毒后第2天开始出现体温升高、发热的现象，第3天体温最高值为40.8℃，之后体温逐渐下降，第10天下降至正常水平；同时临床观察显示，攻毒后第3天开始出现鼻黏膜充血、肿胀，之后出现眼部出现水样分泌物，精神萎靡，食欲不振，第12天痊愈（图1）。第2组在攻毒后第2天～第6天出现体温升高现象，最高值为40.4℃，第7天恢复正常；临床症状明显，鼻腔有大量鼻液、鼻黏膜充血、肿胀，眼部出现水样分泌物，精神萎靡等临床症状（图2）。第3组体温基本没有太大变化，临床症状只出现了轻微的鼻黏膜红肿、流鼻液，第5天后恢复正常（图3）。阴性对照组没有出现IBRV感染常见症状。

2.3病毒分离

攻毒后每天采集鼻拭子，然后加入培养至单层的MDBK细胞96孔板中，观察细胞生长状况。结果显示第1组在攻毒后第2天～第10天均能分离到病毒，第2组在攻毒后第4天～第9天能分离到病毒，其他组未分离到病毒（表1）。实时荧光定量PCR检测结果显示第1组在攻毒后第2天～第10天样本DNA检测呈阳性，其中第7天和第9天的检测结果病毒含量较高；第2组在攻毒后第3～第9天样本DNA检测呈阳性，其中第6天的检测结果病毒含量较高；第3组样本DNA检测第5天呈阳性，但病毒含量较低；阴性对照组未检测到病毒。细胞病变观察结果与实时荧光定量PCR检测结果基本一致。

图1　第1组攻毒后平均体温变化和临床症状平均分值变化Fig.1 The average body temperature and clinical score of group 1after challenge

图2　第2组攻毒后平均体温变化和临床症状平均分值变化Fig.2 The average body temperature and clinical score of group 2after challenge

图3　第3组攻毒后平均体温变化和临床症状平均分值变化Fig.3 The average body temperature and clinical score of group 3after challenge

表1　分离病毒致细胞病变效应观察结果Table 1 The CPE results of isolated viruses

3　讨论

牛传染性鼻支气管炎无特效的药物治疗，所以在发病时不同国家对该病采取的控制方法也不同，一些国家采取了加强护理，预防继发感染，而有的国家对发病牛则进行扑杀。接种疫苗是控制和预防本病的主要措施。但是目前国内还没有商品化的疫苗，因此，研制和开发安全有效的疫苗迫在眉睫。建立恰当的动物感染模型是病原研究，特别是疫苗研制过程中最重要的研究内容。

IBRV可以通过多种途径人工感染牛［1］。最常见的感染类型呼吸道感染途径，感染后病牛可出现高热、咳嗽、流鼻汁、鼻黏膜炎性病变、呼吸困难等呼吸道症状。IBRV也可以通过结膜感染牛，临床表现为结膜炎症，可见结膜充血、眼睑水肿、流眼泪等症状。IBRV还可以通过生殖道感染，主要表现为母牛阴道炎症和公牛龟头炎症。由于IBRV通过呼吸道感染途径对牛的发病率为10%～90%，病死率为1%～5%［11］，且病牛不断从鼻腔、气管向外界排毒，通过空气、飞沫和病牛直接接触而传播［12］，因此对牛群的健康威胁比其他感染途径较为严重。选择鼻腔人工感染途径主要是由于IBRV呼吸道感染造成的临床症状较为严重，并且具备特征性呼吸道黏膜炎症病变，有利于临床观察，为研究鼻腔接种的IBR活疫苗提供客观的评价体系。

研究结果显示，鼻内喷雾接种IBRV/JZ06-8病毒对犊牛可产生有效感染，证明鼻腔内接种这一感染途径是可行的；106.0TCID50/mL、4mL/头的感染剂量即可致犊牛产生明显的体温升高，体温可达40℃以上，产生大量鼻液、鼻黏膜充血、肿胀，眼部出现水样分泌物等典型IBRV感染临床症状，并可在感染期分离到IBRV，说明该剂量可作为感染模型的有效剂量。本研究建立的IBRV犊牛人工感染的模型，可为IBRV研究和IBR疫苗效力评价提供技术支持。

参考文献：

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文献综述

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Establishment of a Calf Infection Model of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus Strain IBRV/JZ06-8

LI Hai-tao，MIAO Li-guang，ZHU Yan-zhu，XIAO Jia-mei，LIU Yan-huan
（Institute of Special Economic Animal and Plant Science，CAAS，Changchun，Jilin，130112，China）

Abstract：To study the infection model of calves with IBRV/JZ06-8，the calves of group1，2and 3were immunized in nasal spray with IBRV/JZ06-8（107.0TCID50/mL，106.0TCID50/mL and 105.0TCID50/mL）4mL/calf.The calves in negative control group was immunized in nasal spray with MDBK 4mL/calf.In 0-14dafter challenge，the body temperature and clinical scores were recorded.The nose swabs were used for virus isolation and identification.The results showed that the calves had typical infection after inoculation in nasal spray with IBRV/JZ06-8（106.0TCID50/mL，4mL/calf），and the IBRV was isolated from the nose swabs.The infection model of calves with IBRV/JZ06-8was established.

Key words：Infectious bovine rhinotracheitis virus；infection model；real-time PCR

作者简介：李海涛（1981-），男，河北邯郸人，助理研究员，主要从事动物病原生物学和分子免疫学研究。＊通讯作者

收稿日期：2014-10-19

中图分类号：S852.653

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0115-04