超高效液相色谱-串联质谱法测定牛羊肉中7种β-内酰胺类抗生素的残留量

吴　强，何生虎＊，陈　娟，余永涛，雷元元，罗瑞明（.宁夏大学农学院，宁夏银川7500；.宁夏回族自治区兽药饲料监察所，宁夏银川7500）



超高效液相色谱-串联质谱法测定牛羊肉中7种β-内酰胺类抗生素的残留量

吴强1，何生虎1＊，陈娟2，余永涛1，雷元元1，罗瑞明1
（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750021；2.宁夏回族自治区兽药饲料监察所，宁夏银川750021）

摘 要：建立了牛羊肉中7种β-内酰胺类药物（青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、头孢喹肟、头孢氨苄）残留检测的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。样品经水和乙腈提取后，用正己烷去除脂肪，再用C18固相萃取柱净化，浓缩定容后，供超高效液色谱-串联质谱法分析。色谱条件：Waters BEH C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流动相1mL/L甲酸水和乙腈进行梯度洗脱；柱温为40℃；进样量为10μL；流速为0.3 mL/min。质谱条件：电喷雾正离子（ESI+）模式电离，多反应监测（MRM）模式检测，外标法定量。结果表明，在5μg/L～500μg/L的基质匹配标准溶液内7种β-内酰胺类药物均有良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.99；样品中7种β-内酰胺类药物的检出限（LOD）均为1ng/g，定量下限（LOQ）均为2ng/g；7种β-内酰胺类药物的平均回收率为80%～108%，相对标准偏差（RSD）小于10%。本方法能够快速、准确的检测出生鲜牛羊肉中7种β内酰胺类药物，为检测牛羊肉中β内酰胺类药物提供了技术支持。

关键词：β-内酰胺类抗生素；牛羊肉；超高效液相色谱串联质谱法；残留检测

β-内酰胺类抗生素（Beta-lactam antibiotics）包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等。该类抗生素具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒性低及临床疗效好等优点。在动物生产中，β-内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛乳房炎、动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等［1-2］。但近年来，由于使用不当或不遵守休药期规定等原因，β-内酰胺类抗生素在畜产品中残留超标的问题屡见不鲜，给动物性食品安全和人类健康带来严重威胁［3-4］。因此，必须加强对动物源食品中β-内酰胺类抗生素的检测和监控，以保障食品安全和人类健康。

目前，用于动物性食品中β-内酰胺类抗生素残留检测的方法主要有微生物法、液相色谱法、理化检测法、酶联免疫法［5-6］、毛细管电泳法［7］、胶体金免疫层析法和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）法［8-10］。其中，LC-MS/MS在进出口动物性食品β-内酰胺类抗生素残留检测中广泛应用［11-14］。本研究拟在传统的LC-MS/MS的基础上，建立灵敏度更高的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）用于牛羊肉中β-内酰胺类抗生素的残留检测，为动物性食品中该类药物残留检测提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 ACQUITY UPLC-Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Waters公司；AE-205电子天平，CT15RT高速冷冻离心机，Organomation Associates氮吹仪，MS1涡旋混合器。

1.1.2试剂与材料 青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、头孢喹肟、头孢氨苄等标准对照品，纯度大于98%；甲醇、乙腈、正己烷等均为色谱纯，Fisher公司产品；C18固相萃取柱（5mL/600mg）为美国Agilent公司产品。

1.2方法

1.2.1标准储备液和工作液的配制 精密称取青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、头孢喹肟、头孢氨苄各10mg，分别加入10mL容量瓶中，用500mL/L的乙腈溶液溶解并稀释成1mg/mL的标准储备液。分别准确吸取各标准储备液0.1mL，加入同一10mL容量瓶中，用水稀释成10μg/mL的混合中间标准工作液。准确吸取1.0mL 10μg/mL的混合中间标准工作液至10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，制得1μg/mL的混合标准工作液。

1.2.2标准曲线绘制 准确吸取适量1μg/mL混合标准工作液，用空白样品提取液配成系列浓度的混合标准溶液，其标准品浓度分别为5、10、50、100、200、500μg/L。从低浓度到高浓度依次进行UPLC-MS/ MS分析，每一浓度分析2次，以特征离子碎片色谱峰面积为纵坐标（y），标准溶液浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.2.3UPLC-MS/MS分析条件 色谱条件：色谱柱为Waters BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）；流动相A为乙腈水溶液，B流动相为1mL/L的甲酸水；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～3min，A流动相的体积分数从5%线性变化至95%，并保持1min；4.0 min～4.1min，A流动相的体积分数从95%线性变化至5%，并保持1.9min。流速0.4mL/min，柱温为40℃，进样量10μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI+），毛细管电压0.5kV，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度400℃，雾化气流速1 000L/h，锥孔气流速50L/h。多反应监测各离子对及对应锥孔电压、碰撞能量等，具体参数详见表1。

表1　7种药物的定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量Table 1 Qualitative and quantitative ion-pair，cone voltage and collision energy of seven drugs

1.2.4样品前处理 将牛羊肉样品用匀浆机匀浆处理，用电子天平称取2g（±0.05g）样品至50mL离心管中，加入2mL水和8mL乙腈，涡漩混合振荡5min，然后12 000r/min离心5min，静置分层，将上清液转移至另一离心管中，加入5mL正己烷，涡漩混合振荡10min，8 000r/min离心5min，弃去上层液，下层溶液作为备用液。依次用5mL乙腈和10mL水润洗HLB固相萃取柱，将备用液加入固相萃取柱，过柱液收集于15mL玻璃管内，并在40℃下用氮气吹至体积小于1mL，然后将液体转移至1.5mL离心管中，定容至1mL［15］。然后用一次性注射器吸取全部溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试液，用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.5药物残留计算公式：

式中，X：试料中相应β-内酰胺类药物的残留量（μg/kg）；

As：对照溶液中相应β-内酰胺类药物的峰面积；

Cs：对照溶液中相应β-内酰胺类药物的浓度（ng/mL）；

A：试样溶液中相应β-内酰胺类药物的峰面积；

V：溶解残余物所用试样溶液体积（mL）；

m：试样的质量（g）。

2　结果

2.1线性范围与回归曲线

当7种β-内酰胺类药物的浓度在5μg/L～500 μg/L范围内时，各种药物的浓度和对应的色谱峰的峰面积均呈现良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.99。以各种药物的特征离子碎片色谱峰面积为纵坐标（y），标准溶液浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到相关的线性回归方程（表2）。将处理好的空白牛羊肉样品逐级稀释标准溶液，按10倍信噪比确定方法的定量限（LOQ）为2ng/g。

2.2精密度与回收率

在空白牛羊肉中添加2、5、10μg/kg的7种β-内酰胺类药物，按照1.2.4中方法进行处理回收，每个浓度作6次重复试验，方法回收率在80%～108%，回收率较好。RSD小于10%（表3）。图1为添加10μg/L的7种药物离子色谱图。

表2　7种药物标准曲线及相关系数Table 2 Standard curves and correlation coefficients of seven drugs

图1　10μg/L标准溶液中7种药物特征离子质量色谱图Fig.1 Characteristic ion mass chromatography of seven kinds of drugs in 10μg/L standard solution

表3　空白牛羊肉中添加7种药物的回收率和精密度试验结果（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of seven drugs added in blank of beef and mutton

3　讨论

由于牛羊肉中存在多种基质效应，在进样前需要进行处理，否则会干扰电喷雾过程的离子化程度，从而影响测定结果的灵敏度和准确性。加之牛羊肉中的蛋白质在进样前必须去除，否则会损害色谱柱，造成色谱柱使用时间降低，因此本文采用HLB固相萃取柱对试样进行净化，平均回收率均在90%以上。可见，HLB固相萃取柱是净化牛奶试样的理想固相萃取柱。而在流动相选择上，通过乙腈水溶液与0.2、0.5、1mL/L甲酸水进行试验，发现1mL/L甲酸水与乙腈水溶液配比时峰形效果最好，因此我们选择1mL/L甲酸水。同时，采用梯度洗脱，随着乙腈水溶液的减少，甲酸水溶液的增加，峰形较好，青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、头孢氨苄、萘夫西林、头孢喹肟的保留时间分别为2.36、2.45、2.59、2.50、1.79、2.54、1.86min。本方法的检测限更加灵敏、快速，7种药物的检测限均为1ng/g，定量下限（LOQ）均为2ng/g，回收率在80%～108%之间，而且出峰时间均在3min内。因此本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定牛羊肉中7种β-内酰胺类类药物，方法线性、回收率和精密度等参数均能满足兽药残留分析方面的要求。该方法将生牛羊肉中7种β-内酰胺类抗生素药物同时确定和定量，大大缩减了操作时间和工作量，降低了检测成本。此方法的建立为生鲜牛羊肉中抗生素药物残留监测工作提供了技术支持。

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Determination of 7β-lactam Antibiotics Residues in Beef and Mutton by UPLC-MS/MS

WU Qiang1，HE Sheng-hu1，CHEN Juan2，YU Yong-tao1，LEI Yuan-yuan1，LUO Rui-ming1
（1.College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia，750021，China；
2.Ningxia Institute of Veterinary Drugs and Feed Supervision，Yinchuan，Ningxia，750021，China）

Abstract：A method for the detection of 7β-lactam antibiotics（penicillin G，penicillin V，oxacillin，cloxacillin，nafcillin，cefquinome，cephalexin）residues in beef and mutton with UPLC-MS/MS was established.After the samples were extracted with water and acetonitrile，removed the fat with n-hexane，then refined by C18solid-phase extraction（SPE），and the concentrated constant volume was analyzed by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Chromatographic conditions：Waters BEH C18column（50mm×2.1mm，1.7 μm），the mobile phase was 1mL/L formic acid-water and acetonitrile for gradient elution，the column temperature was 40℃，the injection volume was 10μL and the flow rate was 0.3mL/min.MS conditions：positive electrospray ionization（ESI+）ionization，multiple reaction monitoring（MRM）mode with the external standard method. The results showed that the seven kinds ofβ-lactams had good linear correlation coefficients（r）in the matrixmatched standard solution 5μg/L-500μg/L，and the correlation coefficients were greater than 0.99；The limits of detection（LOD）in seven kinds ofβ-lactam drugs were 1ng/g，and the lower limit of quantification（LOQ）was 2ng/g；The average recoveries in seven kinds ofβ-lactams were 80%-108%and the relative standard deviation （RSD）was less than 10%.This method can detect the seven kinds ofβ-lactams quickly and accurately in the fresh beef and mutton.It provided the technical support for dectecting theβ-lactam drugs in the beef and mutton.

Key words：β-lactam antibiotics；beef and mutton；UPLC-MS/MS；residue detection

作者简介：吴 强（1989-），男，甘肃白银人，硕士研究生，主要从事临床兽医诊断技术研究。＊通讯作者

基金项目：国家科技支撑计划课题（2012BAK17B07）

收稿日期：2014-12-01

中图分类号：S859.79

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0064-05