Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤生长的影响

赵向东　窦长武△ 　王晓娟　蒋　宁

1)内蒙古医科大学附属医院神经外科　呼和浩特　010050　2)内蒙古医科大学免疫教研室　呼和浩特　010050　3)内蒙古包头市包钢医院神经外科　包头　014010

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤生长的影响

赵向东1)窦长武1)△王晓娟2)蒋宁3)

1)内蒙古医科大学附属医院神经外科呼和浩特0100502)内蒙古医科大学免疫教研室呼和浩特0100503)内蒙古包头市包钢医院神经外科包头014010

【摘要】目的研究Survivin拮抗肽对裸鼠脑胶质瘤的抑制效应。方法将体外培养的人胶质瘤U251细胞经立体定向技术注入裸鼠脑尾状核区域，构建荷U251胶质瘤裸鼠原位模型。荷瘤11 d后，随机分成实验组和对照组，分别经腹腔注射Survivin拮抗肽、生理盐水，30 d后全部处死，制作病理切片和HE染色。应用Olimpus CX41显微镜图像分析系统，计算在肿瘤组织的最大切面上，肿瘤坏死面积与肿瘤面积的比值。结果Survivin拮抗肽实验组裸鼠的肿瘤坏死面积与肿瘤面积的比值大于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05 )。 结论Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长具有抑制效应。

【关键词】胶质瘤；U251细胞；Survivin拮抗肽；裸鼠；抑制

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，手术治疗及常规放化疗效果均不佳。研究发现[1]，Survivin 与胶质瘤的发生、发展及预后密切相关，是脑胶质瘤治疗的潜在靶点。前期体外实验研究发现，Survivin拮抗肽对U251细胞增殖具有抑制作用和促进凋亡效应[2]。本文旨在通过动物实验，研究Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长是否具有抑制效应，为抗胶质瘤肽类药物的研制提供新的依据。

1材料和方法

1.1细胞制备人胶质瘤细胞株U251细胞(内蒙古医科大学免疫教研室提供)置于37 ℃、5% CO2混合气体的培养箱中传代培养, 收集对数生长期细胞, 获得1×107/mL浓度细胞，备用。

1.2裸鼠移植模型建立在超净工作台内，取4~6周龄的BALB/C裸鼠16只(购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量17.9～23.3 g)，乙醚麻醉成功后，酒精消毒，选冠状缝后0.4 cm，中线右0.3 cm为穿刺点，接种细胞量2×104个/只。微量加样器垂直颅骨外板,旋转缓慢进针,落空感后, 继续进针2 mm,缓慢注入,待细胞沉积缓慢拔针。

1.3肿瘤生长观察指标将荷瘤11 d的裸鼠，随机分成A、B 2组，每组8只，A组为实验组，通过腹腔注射Survivin拮抗肽，浓度为20 mg/100 g，1次/d；B组为对照组，通过腹腔注射等量生理盐水，1次/d；荷瘤后的30 d，处死全部裸鼠，分离出脑组织做病理切片和HE染色，选取肿瘤组织的最大切面。用Olimpus CX41显微镜图像分析系统(内蒙古医科大学临床医学研究中心实验室提供)进行图像分析：计算肿瘤坏死面积与肿瘤面积的比值。

2结果

2.1荷瘤后出现的症状裸鼠荷瘤后20~25 d开始出现较为明显的临床症状，即活动性明显降低，对声、光刺激反应迟钝，双眼突出，进食量下降，消瘦(图1、2)。

2.2病理切片分析分离脑组织，可见脑组织表面瘢痕及略向表面隆起的脑组织(图3、4)。在冠状切面上可见大脑中线出现偏移，肿瘤组织呈类圆形，与周围正常脑组织界限不清(图5、6)。普通高倍显微镜下可见肿瘤细胞大小不一且形状不规则，与正常细胞差异明显(图7)，低倍镜下可见肿瘤组织的血管及中间的坏死区(图8)。通过统计分析得出，Survivin拮抗肽实验组的肿瘤坏死面积所占总面积比值大于生理盐水对照组(P<0.05)。见表1。

表1　2组肿瘤坏死面积与肿瘤面积比值

图1、2　裸鼠荷瘤后出现的症状　 　　图3、4　分离脑组织

图5、6肿瘤组织图7高倍镜下肿瘤细胞图8低倍镜下肿瘤组织

3讨论

Survivin 是近几年发现的凋亡抑制蛋白家族中较强的凋亡抑制因子，在胚胎发育过程中和肿瘤组织中表达，而在成熟的终末分化组织中表达甚微或缺失[3-4]。Survivin过度表达可引起细胞凋亡不足，其与肿瘤发生、发展及预后有密切关系[5]，这使得Survivin 的肿瘤靶向治疗具有高度的特异性及安全性。抑制Survivin 的表达, 可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖, 而对正常组织几乎没有影响, 这一特点使得Survivin 成为抗肿瘤治疗的靶点。脑胶质瘤由于其浸润性生长, 手术往往不能全切，化疗及放疗疗效差，不良反应大。Survivin 在脑胶质瘤中的特异性高表达, 为脑胶质瘤的靶向治疗提供了可靠基础[6]。Survivin拮抗肽是以纯化的蛋白为钓饵合成的氨基酸序列，这种小分子多肽具有生物结构简单、易于合成、分子量小、工作浓度高、给药途径多样化等优点，且不良反应较小，无免疫原性[7]，能够促进U251细胞凋亡[2]。裸鼠脑胶质瘤原位移植模型能较好地模拟人类胶质瘤的生物学行为,使用立体定向术接种胶质瘤细胞于鼠尾状核区域，能获得较为满意和稳定可靠的动物模型，具备99%~100%的脑内成瘤率，同时明显减少了颅外生长等不稳定因素的影响[8]。研究发现[9]，U251细胞接种10 d后有肿瘤形成，15 d后开始进入指数生长期，我们实验中的治疗自接种后10 d开始，保证了治疗时间的合理性。

总之，Survivin拮抗肽能够促进人胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的坏死，对其生长具有抑制效应。该项研究进一步证实了Survivin拮抗肽有望成为具有抗脑胶质瘤作用的理想候选药物。

参考文献4

[1]屈洪艳，蔡润. P16和Survivin蛋白在脑胶质瘤中的表达及其临床意义[J].国际检验医学杂志 ，2011，32(4)：466-467.

[2]赵向东，窦长武，王晓娟，等.Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响[J].中国临床神经外科杂志，2013， 18(3)：158-160.

[3] Xue Y, An R, Zhang D, et al. Detection of survivin expression in cervical cancer cells using molecular beacon imaging:new strategy for the diagnosis of cervical cancer [J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2011, 159(1)：204-208.

[4] Zyada MM. Relationship of survivin to clinical drug resistance in Burkitt's lymphoma of the head and neck region[J]. Med Oncol, 2011, 28(4)：1 565-1 569.

[5]Johnson ME，Howerth EW．Survivin：a bifunctional inhibitor of apoptosis protein[J]．Vet Pathol，2004，41(6)：599-607.

[6]彭岱，章翔，甄海宁，等.Survivin在胶质瘤靶向治疗中的研究进展[J].中华神经外科疾病研究杂志，2008，7(4)：378-380.

[7]窦长武，田复明.Survivin拮抗肽的筛选及鉴定[J].中国误诊学杂志 ,2007,7(14)：3 188-3 189.

[8]李承科,霍钢,郑履平,等.快速建立裸鼠胶质瘤模型的实验研究[J].重庆医科大学学报, 2008, 33(1): 73-76.

[9]王伟民, 朱诚, 张光霁, 等. 脑立体定向接种C6细胞建立大鼠脑胶质瘤模型[J ]. 中华实验外科杂志, 1995, 12 (4) : 221-223.

(收稿2014-09-26)

·论著·

The effects of Survivin anti-peptide on the development of tumors transplanted by human glioma U251 cells in nude rats

ZhaoXiangdong,DouChangwu,WangXiaojuan,JiangNing

DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibiting effect of Survivin anti-peptide on nude rats with brain glioma.MethodsThe rat orthotopic model of U251 glioma was established through transplanting human glioma U251 cells cultured in vitro into caudate nucleus of nude rats by stereotactic technique. After 11 days, all nude rats were randomly divided into experimental group and control group, which were separately injected Survivin anti-peptide and normal saline via abdomen injection. After 30 days, we executed all of nude rats and made pathological sections and HE staining. Then the ratio of tumor necrotic area and tumor total area was calculated on the largest slice of tumor tissues by the analysis system of Olimpus CX41 microscope image.ResultsThe ratio of tumor necrotic area and tumor total area in experimental group was greater than that in control group (P<0.05).ConclusionThe Survivin anti-peptide have inhibitory effect on the development of tumors transplanted by human glioma U251 cells in nude rats.

【Key words】Glioma; U251 cells; Survivin anti-peptide; Nude rats; Inhibition

通讯作者：△窦长武，E-mail：douchangwu@sina.com

基金项目：内蒙古自然科学基金(编号200408020902)；内蒙古医学院第一附属医院重大项目(编号200405)

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1573-5110(2015)18-0001-02