紫杉酚纳米纤维对肿瘤生长和新陈代谢的抑制作用

李翔

摘要：水凝胶分子在药物靶向制剂方面具有广阔的应用前景。为此，主要对常用抗癌药紫杉酚制备水凝胶分子进行研究。将紫杉酚衍生物（Taxol-SAGSSG，化合物1）制成水凝胶，注入固体肿瘤，可显著抑制肿瘤生长，阻止新陈代谢。通过静脉注射紫杉酚，可以提高抗癌效果；血液中的紫杉酚浓度较低，可提高小鼠对紫杉酚的耐药性，减少化疗过程中的副作用。

关键词：紫杉酚纳米纤维；水凝胶；抑制

中图分类号：TB

文献标识码：A

doi：10.19311/j.cnki.1672.3198.2016.28.104

1 引言

采用临床用紫杉酚制备水凝胶。为克服化疗期间抗癌药物的缺点（低水溶性和系统毒性），对药物载体进行了大量研究，药物载体可以增加抗癌药（如：紫杉酚、喜树碱和阿霉素）的水溶性，靶向给药于癌细胞。聚合物水凝胶、纳米药物载体已得到广泛应用，如脂质体、DNA、共聚物，自组装的分子水凝胶在用作疏水性抗癌药的靶向给药系统方面具有很大的潜力。

尽管分子水凝胶已经在抗癌药给药系统领域得到广泛应用，但制备时间长、成本高。FDA认可的分子水凝胶给药系统中，只有两种是未经化学修饰，由药剂本身形成的。由药剂本身形成的分子水凝胶给药系统具有更广阔的应用前景。本文主要研究紫杉酚水凝胶，用于瘤内给药，提高抗癌效果，降低系统毒性。

2 材料和方法

2.1 制备水凝胶

在37℃条件下，将20mg的化合物1和2.2当量的Na2CO3溶解于1.0mLPBS缓冲溶液（pH=7.4）中，放置12h制得胶体。

2.2 分析制备水凝胶时的水解过程

在不同时点，取20mL上述浓度的溶液，加入200mL甲醇，然后取一定量清液进行液质色谱分析，通过液质色谱的峰面积测定Taxol-SA-GSSG水解后的成分。

2.3 水凝胶体外释放紫杉酚规律

0.25mL的凝胶（在37℃条件下，放置4天形成1.0wt%，1.5wt%，和2.0wt%的凝胶），分别用0.25mL新鲜的PBS缓冲溶液（pH7.4）进行滴定。每隔一段时间，取出0.2mL上述溶液和对照溶液进行LC-MS检测，通过液质光谱峰的面积来测定凝胶释放紫杉酚的百分含量，每组进行4次平行实验。

2.4 体内药物毒性

在小鼠右翼注射一定量的水凝胶，每隔一天计算一次小鼠的相对体重。计算公式：相对体重=体重/原体重*100%。

2.5 药代动力学分析

在年龄、性别相当的小鼠右翼，分别注射50μL三种剂量的水凝胶（10、20、40mg/kg）PBS溶液，在指定时间内抽取血样，对照组经过同样的方法处理。在指定时间间隔内，收集500μL血样放入肝素化管中。离心10min后制得血浆样品，通过液萃取，将紫杉酚从血浆中分离出来，测算药物动力学参数。

2.6 体外评估抗肿瘤效果

EL-4细胞和4T1-荧光素酶细胞均在实验室保存。注射2×105EL-4细胞的小鼠作为淋巴瘤的动物模型；在乳房脂肪垫中注射2×1054T1-荧光素酶细胞的雌性小鼠，作为乳腺肿瘤的动物模型；每隔一天测算一次肿瘤的体重，通过公式来计算肿瘤体积：长×宽×（长+宽）/2。当肿瘤体积达到500mm3时，将小鼠随机分组，包括：（1）淋巴瘤动物模型：10mg/kg*2紫杉酚；乳腺肿瘤的动物模型：10mg/kg*4TaxolR；从0天起，在规定的时间内，每隔一天注射一次TaxolR；（2）瘤内注射50mL10mg/kg，20mg/kg和40mg/kg的水凝胶；（3）瘤内注射PBS缓冲溶液作为对照组；给药当日记为0天。小鼠在接受治疗后的体重，记作相对重量（%）。

3 结果与讨论

3.1 分子设计与水凝胶形成过程

紫杉酚衍生物经过酯键水解，释放出紫杉酚分子，从而形成分子水凝胶。设计的化合物1Taxol-SA-GSSG具有以下优势：（1）丁二酸（SA）和氧化谷胱甘肽（GSSG），可用于活的有机体内；（2）GSSG具有较强的亲水性，可以提高化合物1的水溶性；（3）GSSG市场上有卖，使化合物1的合成简单易行。因此可用作分子凝胶因子（紫杉酚）的前体。

在室温（22～25℃）或37℃下，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），制备含有2.0wt%的化合物1溶液，用于测定凝胶性能。在室温和37℃条件下，6小时后，观察水凝胶的形成过程。LC-MS检测结果显示，在凝胶点、4天后和7天后，紫杉酚和SA分别自组装形成57%，90%和95.4%的酯键。酯键的水解速度，主要依赖于溶液的pH值，pH值越高越容易，反之亦然。溶液的pH值不高于8.0，此外，紫杉酚上的酯键也可以被水解。水凝胶在室温或在4℃时，可以稳定存在，在PBS缓冲溶液（pH7.4）的水凝胶，在室温下可保存3个月，酯键没有发生任何水解。化合物1和PBS缓冲溶液水解过程的浓度范围0.5～15.0wt%（低于0.5wt%一周后溶液澄清，化合物1在缓冲溶液中浓度为15wt%时最稳定）。紫杉酚水凝胶只能通过水解过程形成，加热-冷却或借助有机溶剂都不能制得。实验结果表明，紫杉酚可以通过水解过程形成水凝胶，在形成的水凝胶中紫杉酚浓度范围较大。

3.2 血流计

采用血流计表征水凝胶的机械性能，测试水凝胶能否注射。血流计在含有2wt%化合物1的PBS溶液中静止24h后，进行动态频率扫描。用注射器吸入凝胶，然后注入到小瓶中，5分钟后，会再形成凝胶。结果显示，形成的紫杉酚水凝胶可用于动物皮下组织注射。

3.3 纳米纤维形态学

可以通过扫描电镜（TEM）观察到宽约25nm、长约几个微米的纳米纤维。这些纳米纤维组成三维网状结构，形成水凝胶。

3.4 体外释放

在生理温度37℃条件下，研究紫杉酚凝胶的体外释放过程。将0.25mL的PBS缓冲溶液滴加到0.25mL含有不同浓度化合物1（原浓度=1.0，1.5和2.0wt%）的凝胶中。在预定时间点，取出适量溶液用于检测凝胶中累计释放紫杉酚的量，再加入0.25mL新鲜的PBS缓冲溶液。结果表明含有不同浓度的紫杉酚凝胶具有相似的释放特性。在刚开始的8小时，均以每小时1.4mg的速度释放，在随后的16小时里，以每小时0.75mg的速度释放。

3.5 最小致命剂量

单次注射紫杉酚的剂量不超过20mg/kg，会对小鼠造成严重毒性，小鼠恢复正常行动至少需要24小时。单次注射紫杉酚的剂量为40mg/kg时，对小鼠是致命的，因此临床注射紫杉酚的致命剂量在20～40mg/kg之间。与紫杉酚相比，紫杉酚水凝胶在小鼠体内毒性较低。尽管小鼠在皮下注射150mg/kg紫杉酚水凝胶后，最初的几天里体重下降，但致命剂量高达300mg/kg，是紫杉酚的7.5倍。在皮下注射紫杉酚水凝胶的剂量高于40mg/kg之后，4～7天内，会对小鼠的皮肤造成伤害，这是由于紫杉酚对所有细胞都有毒性。由此可知，高剂量紫杉酚水凝胶只能用于肿瘤内注射，而不能用于皮下注射，因为紫杉酚水凝胶会对皮下细胞造成损伤，影响病人的身体健康。为了使紫杉酚水凝胶在皮下组织发挥作用，建议用量低于20mg/kg。

3.6 抗肿瘤效果

采用小鼠右侧皮下组织的EL-4淋巴瘤动物模型和雌性小鼠4T1-荧光素酶乳腺肿瘤模型。研究紫杉酚水凝胶在体内的抗肿瘤效果，当乳腺肿瘤的体积达到435mm3时，向肿瘤中注射相同体积（50mL），不同剂量（10、20、40mg/kg紫杉酚）的水凝胶。结果显示，紫杉酚水凝胶可以有效阻止乳腺肿瘤的生长，与相同剂量的紫杉酚相比，抗肿瘤效果更好。

3.7 抑制新陈代谢

直接将紫杉酚水凝胶注入肿瘤，可抑制乳腺癌的新陈代谢。可注射一定量荧光素酶作为基底（D-荧光素），对体内癌细胞进行定位。与对照组相比，注射紫杉酚水凝胶溶液（10，20和40mg/kg）的小鼠，没有明显的新陈代谢过程，说明肿瘤内的癌细胞已经被紫杉酚消灭。

3.8 对体重和血浆浓度的影响

为了研究紫杉酚水凝胶对不同肿瘤的效果，记录小鼠的体重变化。结果表明采用水凝胶治疗的小鼠体重没有明显降低，与对照组相比，注射水凝胶剂量低于80mg/kg的小鼠，都保持正常体重。采用体内缓释给药时，小鼠血液中紫杉酚浓度较低，说明水凝胶具有较强的生物相容性，缓释给药可减小对正常组织的副作用。

4 结论

结果表明，制备的紫杉酚水凝胶，可用于阻止肿瘤生长和新陈代谢；GSSG、PEG等亲水性化合物均可用作制备紫杉酚水凝胶的前体；紫杉酚水凝胶在血液中浓度低、抗肿瘤效果好；在化疗和临床应用中都具有很大的发展潜力。

参考文献

[1]Marupudi NI，Han JE，Li KW，Renard VM，Tyler BM，Brem H.Paclitaxel：a review of adverse toxicities and novel delivery strategies[J].Expert Opin. Drug Saf.，2007，（5）：609.21.

[2]Shen YQ，Jin EL，Zhang B，Murphy CJ，Sui MH，Zhao J，et al.Prodrugs forming high drug loading multifunctional nanocapsules for intracellular cancer drug delivery[J].J Am Chem Soc.，2010，（12）：4259.4265.