去骨瓣减压对心跳骤停大鼠脑复苏的影响

冯　凯, 王瑞刚, 赵春香, 张　磊, 石秋艳

(河北联合大学附属医院 NICU, 河北 唐山, 063000)

去骨瓣减压对心跳骤停大鼠脑复苏的影响

冯凯, 王瑞刚, 赵春香, 张磊, 石秋艳

(河北联合大学附属医院 NICU, 河北 唐山, 063000)

摘要:目的探讨去骨瓣减压对心跳骤停大鼠脑复苏的影响。方法选取成年雄性Wistar大鼠48只，随机分为假手术组(n=16)、对照组(n=16)、去骨瓣干预组(n=16)。每组又分为A(6 h)、B(12 h)、C(24 h)、D(48 h)4个亚组。对照组与去骨瓣干预组采用窒息致大鼠心脏骤停(CA)和心肺复苏(CPR)模型。去骨瓣干预组在大鼠心肺复苏成功1 h后行去骨瓣减压。假手术组仅行气管插管、股动静脉置管术。分别于各时间点取血和组织标本，以免疫组化染色法测定的内源性白蛋白渗出的面积百分比来表示BBB的破坏程度，ELISA法检测血清S100b蛋白质量浓度，TUNEL法检测细胞凋亡变化，HE染色观察海马及大脑皮质细胞大体形态。结果与假手术组比较，对照组及去骨瓣干预组BBB的破坏程度于6 h后开始加重，并持续上升至12 h并达到峰值，之后略有下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，去骨瓣干预组自主循环恢复(ROSC)后12 h显著降低(P<0.01), 6 h、24 h、48 h亦降低(P<0.05)。与假手术组比较，对照组血清S100b蛋白在ROSC后6 h明显升高，并持续上升至12 h达峰值, 24 h、48 h有所回落，差异具有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，去骨瓣干预组ROSC后6、12、24、48 h显著降低(P<0.01)。假手术组仅可见≤3个散在的凋亡细胞出现在皮质。对照组和去骨瓣干预组可见皮质有大量神经元、胶质细胞及部分血管内皮细胞发生凋亡。去骨瓣干预组细胞凋亡数量较对照组明显减少(P<0.05)。结论去骨瓣减压能减轻血脑屏障的破坏程度，降低大鼠心肺复苏后血清中S100b蛋白的表达，减少细胞凋亡，从而减轻脑损伤。

关键词:心肺复苏; 去骨瓣减压; 血脑屏障; S100b蛋白; 脑损伤; 细胞凋亡

应用去骨瓣减压术治疗大面积脑梗死已取得了较好的临床效果。Forsting等[1]在实验性大脑中动脉闭塞动物模型上均已证实，去骨瓣减压术可明显改善动物的神经功能、降低病死率和减少梗死灶体积，但去骨瓣减压术对窒息性心脏骤停脑保护的作用目前尚未明了。本课题拟在以前研究的基础上进一步研究去骨瓣减压术对窒息性心跳骤停大鼠血脑屏障(BBB)、细胞凋亡及S100b蛋白表达的影响，以探讨该手术对窒息性心跳骤停大鼠是否有脑保护作用。

1材料与方法

1.1　实验动物及分组

选取成年清洁级雄性Wistar大鼠48只，体质量280～380 g, 随机分为假手术组、对照组、去骨瓣组，再将各组按6、12、24、48 h分为4个亚组，每个亚组4只大鼠。实验前禁食12 h, 不禁水。其中假手术组只行气管插管和股动静脉置管术。

1.2　实验模型制作

参照参考文献的方法制作改良后的窒息性心跳骤停模型[2,10,11]。腹腔注射9%水合氯醛(0.33 mL/100 g, 河北联合大学中心实验室)麻醉，将大鼠固定于手术板上，针状电极置于皮下，监测心电图(ECG)。分别行气管插管和右侧股动、静脉置管术。气管插管后连接TKR-200C小动物呼吸机，行高频喷射通气，吸入空气，通气频率80次/min, 通气压力<0.02 mPa。经右股静脉输注生理盐水0.01 mL/(g·h), 股动脉接换能器监测动脉压及心率稳定10 min。窒息前5 min静脉注射阿曲库铵0.1 mg/kg(上海恒瑞医药有限公司，批号: 14042722)。夹闭气管导管直至动态心电监测示心电活动消失，且平均动脉压<20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa), 8 min后经右股静脉插管注入肾上腺素40 μg/kg, 同时开放气道机械通气，并给予心外按压，按压频率为200次/min，深度为胸廓前后径的1/3，动脉波形恢复且MAP>40 mmHg示为按压有效，自主循环恢复平均动脉压>60 mmHg, 心率>250次/min示为复苏成功。死亡或者复苏时间超过10 min的大鼠剔除本研究。1 h后结扎动静脉，缝合皮肤，拔出气管插管，完成窒息性心跳骤停复苏模型。假手术组动物仅进行麻醉和气管插管、股动静脉置管，不进行夹管窒息及CPR。

1.3　去骨瓣干预治疗

去骨瓣组大鼠于窒息性心跳骤停复苏模型成功1 h后，切开头皮，擦拭分离筋膜，完全暴露另一侧顶骨，用显微牙科钻在顶骨边缘上均匀的打孔，配合牙科镊将大鼠一侧顶骨取下, 骨瓣大小约9 mm ×5 mm，放射状切开硬脑膜，止血、缝合头皮。

1.4　标本的采集

每亚组大鼠分别于术后6、12、24、48 h后腹腔麻醉，立即开胸暴露心脏，迅速取大鼠上腔动脉血2 mL(待离心)，之后速断头取脑，用4%多聚甲醛液固定24 h 后常规脱水、石蜡包埋，每个标本从前联合开始连续切片3张，切片厚度5 μm, 1张切片用于HE 染色, 1张用于免疫组化染色法测定内源性白蛋白渗出的面积百分比，最后1张用于TUNEL法检测细胞凋亡变化。将每只大鼠留取的静脉血离心(3 500 r/min, 10 min), 取上清液于EP管，置于-80 ℃冰箱保存，批量待测。测定血清S100b蛋白浓度，测定步骤严格按试剂盒操作说明进行。

1.5　BBB破坏程度[3]

蜡块切片后脱蜡，用10%小牛血清100 μL室温封闭30 min, 之后切片置于1%的H2O2中室温反应20 min, 其中免疫反应一抗为1∶200羊抗大鼠白蛋白抗体( Biodesign, Inc. USA), 二抗为1∶200 辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG (Southern Biotechnology Associates, Inc. USA), 显色剂为DAB/H2O2。空白对照以0.05 mol/L TBS缓冲液替代一抗，其他步骤不变。BBB破坏范围的计算方法: 取通过前联合层面的脑片作为计算BBB破坏的面积，面积用计算机医用图像分析系统完成。BBB破坏面积百分率(%)=[(Sc-Si)/Sc]%(Sc正常脑组织面积, Si为对照组或去骨瓣组脑组织面积)[4]。

1.6　细胞凋亡检测[5]

标本切片常规脱蜡、水化，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒提供的实验步骤进行操作。以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞。显微镜下阳性细胞计数。

2结果

2.1　各组血脑屏障破坏的程度

与假手术组比较，对照组及去骨瓣干预组BBB的破坏程度于6 h后开始加重，并持续上升至12 h达峰值，差异具有统计学意义(P<0.05); 与对照组比较，去骨瓣干预组ROSC后48 h显著降低(P<0.01), 6、12、24 h降低(P<0.05)。见表1。

±s)

与假手术组比较，#P<0.05; 与对照组比较，*P<0.05。

2.2　各组大鼠血清S100b蛋白含量变化

与假手术组比较，对照组、去骨瓣组ROSC后6 h起血清S100b蛋白含量明显升高，并持续上升至12 h达峰值, 24 h有所回落，差异均有统计学意义(P<0.05); 与对照组比较，去骨瓣组ROSC后12、24、48 h显著降低(P<0.05)。见表2。

μg/L

与假手术组比较，#P<0.05; 与对照组比较，*P<0.05。

2.3　各组大鼠脑细胞凋亡检测

假手术组仅可见≤3个散在的凋亡细胞出现在皮质。对照组和去骨瓣干预组可见皮质有大量神经元、胶质细胞及部分血管内皮细胞发生凋亡。去骨瓣干预组大鼠不同时点细胞凋亡数量(个)较对照组明显减少(P<0.05)。见表3。

±s)

与假手术组比较，#P<0.05; 与对照组比较，*P<0.05。

2.4　HE染色观察组织结构及细胞形态结构比较

对照组：大脑皮层及海马可见不同程度的神经元细胞损伤表现。心肺复苏后6 h组：可见大脑皮层及海马区神经元细胞轻度水肿，部分细分细胞核浓染，固缩。心肺复苏后12 h组：神经元细胞水肿加重，神经毡疏松，大量细胞核浓染，固缩，局部可见少量三种深染单核淋巴细胞浸润。心肺复苏后24 h组：神经元坏死明显，细胞数量减少，呈空泡状，剩余的细胞大部分固缩深染，核仁消失，部分细胞核碎裂、细胞核固缩深染，核仁消失，部分细胞溶解，甚至消失，脑质细胞增生。心肺复苏后48 h组：神经细胞失去完整的结构状态，明显出现核碎裂，细胞周围高度水肿，可见大量胶质细胞增生。

去骨瓣组：6 h较对照组未见明显变化，12、24、48 h后大脑皮层及海马可见神经元细胞坏死减少，胶质细胞增生，大量新生毛细血管。

假手术组：神经细胞数量及形态结构分布正常，未见神经元病理性损伤。

3讨论

脑缺血导致BBB通透性增加，表现为血浆蛋白等物质通过开放的BBB渗漏到损害区[9,15]。研究[6-7]发现，自脑缺血后6 h始即可检测到白蛋白( BBB 开放)，一般于缺血后48～72 h 达高峰，以后逐渐下降。通过直接或经标记后测定渗出的物质, 可以用来分析BBB破坏的程度和范围。本研究发现在心肺复苏成功后48 h, 去骨瓣减压组能明显缩小白蛋白渗出的范围(P<0.05)。去骨瓣减压术增加了脑血流量，改善微循环，改善全脑的血液供应，同时也使该区域的血管本身得到血供，使血管内皮细胞免受缺血性损害, BBB破坏范围缩小。

S100b蛋白主要分布于中枢神经系统、外周神经系统的神经胶质细胞和施万细胞[8]。生理量的Sl00b蛋白作为钙传感器具有广泛的生物学活性，调节细胞的能量代谢，作为细胞内正常成分参与细胞内外钙离子水平的调节，促进神经的生长和损伤的修复[12]。但高浓度S100b蛋白对神经元具有毒性作用，升高神经元细胞内钙离子浓度，导致胞内钙超载，诱导神经元凋亡或坏死[13-14], 而神经元的死亡又可引发小胶质细胞活化和白细胞介素-1的分泌，后者上调星形胶质细胞表达S100b蛋白，形成一个正反馈环路，加重神经元凋亡或坏死[15]。S100b蛋白过量表达将增加大脑对缺血缺氧损伤易感性，与急性脑损伤直接相关。脑损伤时神经胶质细胞S100b蛋白表达的增加，导致脑脊液和血液S100b蛋白水平的升高。动物实验和临床研究表明，脑创伤后脑脊液和血清中S100b蛋白含量升高，升高程度与脑损伤程度及预后有相关性。本研究结果显示，去骨瓣减压术后，伴随S100b蛋白表达降低的同时，大脑皮质细胞凋亡数量也明显降低。因此，去骨瓣减压术可能通过改善脑组织血供，减少细胞凋亡，对脑组织起到保护作用。

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Effect of decompressive craniectomy on cerebral

resuscitation of cardiac arrest rats

FENG Kai, WANG Ruigang, ZHAO Chunxiang, ZHANG Lei, SHI Qiuyan

(NICU,AffiliatedHospitalofHebeiUnionUniversity,Tangshan,Hebei, 063000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of decompressive craniectomy on cerebral resuscitation of cardiac arrest rats. MethodsA total of 48 adult male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group (n=16), control group (n=16) and craniectomy intervention group (n=16). Each group was further divided into four subgroups of A (6 h), B (12 h), C (24 h), and D (48 h). The control group and craniectomy intervention group adopt rat cardiac arrest (CA) and cardiopulmonary resuscitation (CPR) model caused by suffocation. Rats in the craniectomy intervention group operated decompressive craniectomy after 1 h of successfully cardiopulmonary resuscitation (CPR). The sham-operated group only had endotracheal intubation and femoral arteriovenous catheter. The blood and tissue samples were collected respectively at each time point, immune-histochemical staining method was used to detect the endogenous albumin leakage area percentage which showed the BBB damage, ELISA method was applied to detect the serum S100b protein mass concentration, and TUNEL method was applied to detect the change of apoptosis, and HE staining was to observe the hippocampus and cerebral cortex cells form. ResultsCompared with the sham-operation group, BBB damage degree aggravated 6 h later in the control group and the decompressive intervention group，raised until the point of 12 h and reached the peak, then it was slightly down, the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the control group, the decom pressive intervention group′s spontaneous circulation recovery (ROSC) significantly decreased 12 h later (P<0.01), 6 h, 24 h and 48 h also decreased (P<0.05). Compared with the control group, control group′s serum S100b protein in ROSC significantly increased 6 h later, raised to the peak at 12 h, and declined in 24 h and 48 h, there was statistically significant difference (P<0.01). Compared with the control group, the decompressive intervention group decreased significantly after ROSC at 6, 12, 24 h and 48 h (P<0.01). There were only less than 3 scattered apoptotic cells seen in cortex in the sham-operated group. A large number of neurons, glial cells and part of the vascular endothelial cell apoptosis were available in cortex in the control group and the decompressive intervention group. The number of cell apoptosis in the decompressive intervention group decreased significantly than that of the control group (P<0.05). ConclusionThe decompressive craniectomy can reduce the damage rate of the blood brain barrier, decrease S100b protein expression in serum after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in rats, and reduce the apoptosis so as to reduce the brain damage.

KEYWORDS:cardiopulmonary resuscitation; decompressive craniectomy; blood-brain barrier; S100b protein; brain damage; cell apoptosis

通信作者:王瑞刚

基金项目:河北省卫计委指令性课题(ZL20140143)

收稿日期:2015-03-02

中图分类号:R 541.7

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)11-005-04

DOI:10.7619/jcmp.201511002