HBV基因突变与肝细胞癌发生关系研究进展

粘学渊，许智慧，刘 妍，徐东平

·专题综述·

HBV基因突变与肝细胞癌发生关系研究进展

粘学渊，许智慧，刘 妍，徐东平

HBV感染是引起肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）发生的主要因素，超过50％的HCC发生与HBV感染有关，因此HBV防治成为全球医疗热点问题。HBV包含4个开放阅读框（preS/S、preC/C、P、X），它们中的各种点突变、缺失、插入及截短突变与HCC发生相关。一些突变和乙型肝炎重症化有关，可作为预测HCC发生的生物学指标；一些突变产生的特定HBV抗原直接或间接调节细胞周期及细胞凋亡等相关蛋白分子，促进细胞增殖及染色体不稳定，增加HCC发生风险。

乙型肝炎病毒；癌，肝细胞；突变

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在男性常见的肿瘤中排第5位，占男性所有肿瘤的7.5％；在女性中排第9位，占女性所有肿瘤的3.4％。在世界范围内HCC是导致死亡的第二大常见肿瘤，仅2012年就有746 000例死于HCC[1]。据统计我国大陆地区新发HCC和死于HCC患者数均占全球总数约50％[2]。目前已经证实HBV感染是引起HCC发生的主要因素，基因突变、病毒整合和宿主的易感性都被认为是导致HBV相关HCC发生的危险因素[3]。HBV复制过程中聚合酶缺乏校对功能，导致病毒具有高度变异性。HBV基因4个部分重叠开放阅读框（preS/S、P、preC/C、X）发生的各种点突变、缺失、插入、截短突变与HCC发生密切相关[4]。针对HBV基因突变与HCC之间的关系，近几年国内外学者做了大量研究。本文系统总结相关文献，旨在讨论HBV基因突变在预测HCC发生及致癌过程中的相关机制。

1preS/S基因突变与HCC的关系

S读码区分为preS1基因、preS2基因和S基因，表达大、中、小3种蛋白。大蛋白的起始密码子位于preS1基因，中、小蛋白的起始密码子位于S2基因，三者共用同一终止密码子。大、小蛋白的功能是形成HBV外壳，中蛋白能够增强病毒的分泌能力。近年来不断深入的研究发现，preS基因的缺失突变能导致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗体结合能力发生改变，这些都被认为会导致疾病进展，并最终发展为HCC的潜在机制。

S基因突变与HCC发生的相关区域位于preS区，目前亚洲地区已有大量文献报道HBV preS缺失突变与HCC发生相关，Wang等[5]对亚洲地区17项关于preS缺失突变与HCC发生关系的病例对照研究进行荟萃分析，结果表明乙型肝炎（乙肝）患者HBV基因preS缺失突变，发生HCC的风险增高3.9倍。进一步分析我国大陆地区preS缺失变异情况，发生HCC的风险增高4.84倍，说明我国大陆地区HBV preS缺失后发生HCC的风险更高。我国一项研究发现HBV preS缺失和preS2起始密码子突变与HCC发生相关，多变量分析显示preS缺失和preS2起始密码子突变导致HCC发生风险分别增高2.434和3.065倍。进一步纵向研究发现，在HBV感染初始阶段preS缺失突变没有被发现，随着疾病的进展preS缺失突变率增高[6]。该课题组的前期研究也揭示了在慢性HBV感染者中，随着疾病进展HBV preS基因缺失发生率呈上升趋势，preS2基因缺失突变率在HCC患者中显著增高，preS2基因缺失可能参与驱动HBV慢性感染的疾病进展[7]。然而，有研究发现在儿童阶段HBV preS缺失突变就可发生，儿童发生HCC与HBV preS缺失突变显著相关[8-9]。在儿童HCC患者的血清中，有近一半检测到HBV preS2缺失突变；而儿童慢性乙肝患者的血清中，并未发现preS2缺失突变[8]。另一项对儿童HCC患者肝组织的研究发现，80％患者有HBV preS2缺失变异[9]。提示preS缺失突变在早期年龄阶段就可发生，与儿童HCC发生相关。

近年国内外学者就HBV preS缺失突变导致HCC做了大量分子机制方面的研究。值得注意的是，preS2缺失突变抗原作为基因反式激活因子和内质网压力的诱导物，可导致染色体不稳定[10-11]。过往研究表明，preS2突变抗原作为基因反式激活因子，上调细胞周期蛋白A，抑制细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖激活酶4，诱导转基因小鼠肝脏呈结节状生长[10]。近年一项研究发现HBV preS2突变抗原在内质网内聚集，导致内质网压力增大，此过程能够诱导异常细胞周期蛋白A的表达以及细胞中心体过度合成，导致染色体不稳定，可能是HBV致HCC发生的一个潜在机制[11]。另一项研究纳入韩国241例乙肝相关疾病患者，发现F241L突变与HCC显著相关。进一步的细胞功能学研究发现F141L-HBV表面大蛋白（hepatitis B virus large surface protein,LHBs）能够通过下调p53、p21途径，以及上调细胞周期蛋白依赖性激酶4和细胞周期蛋白A导致细胞周期缩短。在集落形成实验中发现，表达F141L-LHBs细胞的集落形成速率是野生型细胞的2倍。因此，F141L-LHBs可能通过诱导细胞的增殖导致HCC发生[12]。

2P基因突变与HCC的关系

HBV P基因开放阅读框编码聚合酶，P基因突变与核苷（酸）类似物耐药相关。尽管P基因不如其他基因与HCC发生密切相关，但是抗病毒治疗产生的耐药突变会导致疾病进展。近年抗病毒耐药后是否增大HCC发生风险，以及HBV核苷（酸）类似物相关耐药基因与发生HCC关系成为研究热点。

有研究表明，自然条件下发生的HBV RT基因点突变A799G、A987G和T1055A是HCC发生的独立危险因素。纵向研究发现这些突变在HCC发生前4、5年就能检测到，可能与HCC发生相关[13]。一项失代偿期肝硬化患者前瞻性队列研究发现，耐药患者（30.6％）比完全病毒学应答患者（4.3％）2年HCC累积发病率显著提高，且在耐药发生后补救治疗失败患者中发生HCC的概率为55.6％。HBV DNA测序发现，rtA181T突变与耐药拯救治疗失败密切相关，间接表明rtA181T耐药突变可能与HCC发生相关[14]。另一项对拉米夫定（LAM）耐药的123例慢性乙肝患者研究发现，HBV rtA181T/sW172*提前终止突变增加了耐LAM慢性乙肝患者发生HCC的风险[15]。进一步的功能学研究揭示rtA181T/ sW172*突变导致分泌的病毒颗粒有缺陷，引起细胞内HBsAg滞留，与野生型病毒共存时，对病毒体而非病毒亚单位分泌产生显著负性影响，这都可能与致癌性相关[16]。

3CP/preC/C基因突变与HCC的关系

HBV核心启动子位于基因组nt1613～nt1849，与X基因开放阅读框的3′-端和preC基因5′-端重叠，由上游调控区（upper regulatory region,URR）（nt1613～nt1742）和基本核心启动子区（basal core promoter,BCP）（nt1742～nt1849）组成。核心启动子区对HBV的复制和转录起着重要的作用，它调控着preC/C RNA和pgRNA的合成。preC/C RNA是HBeAg前体合成的模板。pgRNA经翻译生成HBcAg，也是HBV反转录、聚合酶合成的模板。核心启动子区及preC区突变与HCC发生的相关性已被大量报道[4，17]。

Li等[18]发现HBV核心启动子URR G1613A突变在HCC患者中更加常见。深入的分子研究也发现重组调节因子X1作为反式激活剂与HBV负性调控区结合，并且与G1613A突变基因序列的结合比野生型更加紧密。功能学研究发现G1613A突变能够有效提高核心启动子活性并增加病毒载量，增大HCC发生风险。另一项研究发现HBV核心启动子URR G1613A和C1653T双突变在HCC患者中更加常见，且单独的G1613A突变与未来HCC的发生有相关性[19]。BCP的热点突变有T1753A/C、A1762T、G1764A、C1766T等，其中以A1762T/G1764A双联突变最为常见。一项研究表明A1762T/G1764A双联突变对HCC的发生必要，三联突变发生HCC风险高，四联突变风险性更高[20]，该结论与另一项研究一致[21]。但是Chu等[22]通过比较HBV BCP突变与有肝硬化基础HCC和无肝硬化基础HCC的关系，发现HBV BCP突变与肝硬化相关，与HCC发生无关。对HBV CP区突变与HCC发生关系的分子机制研究近几年也有新发现。研究表明HBV CP区A1762T/G1764A┼T1753A┼T1768A联合突变能降低p21水平，以及增加细胞周期蛋白E表达，也可通过上调S期激酶相关蛋白2降低p21表达量，加快细胞增殖。因此，HBV CP区联合突变可能通过这种途径导致HCC的发生[23]。另一项研究表明HBV CP区突变可通过活化转录因子E2F1以及下调细胞周期抑制物，增强S期激酶相关蛋白的表达，缩短细胞增殖周期，这可能是HBV CP区突变增大HCC发生风险的另一个潜在机制[24]。

HBV preC区最常见的突变是G1896A，该突变可使28位色氨酸（TGG）变为终止密码（TAG），导致HBeAg合成提前终止。此外，preC区1862、1899位点变异导致所编码氨基酸改变，使HBeAg前体不能被信号酶裂解，影响HBeAg分泌。一项研究发现preC G1899A突变与HBeAg阳性有肝硬化基础患者发生HCC相关，而preC G1896A突变与HBeAg阴性无肝硬化基础患者发生HCC相关[25]。HBV C区变异，尤其是主要组织相容性复合物Ⅱ类限制性T细胞表位区的变异被发现与基因C型慢性乙肝患者发生HCC显著相关[26]。

4X基因突变与HCC的关系

HBV X基因开放阅读框编码X蛋白，尽管一些体外研究发现HBx对病毒复制是必要的，但HBx对于病毒复制的具体功能仍然没有完全明确。X基因与基本核心启动子区及增强子Ⅱ重叠，因此X基因突变有可能会影响病毒复制。先前转基因动物实验虽已表明HBx有致癌性[27]，但其具体机制目前仍不清楚。近几年国内外学者围绕HBx调节细胞增殖及凋亡通路导致HCC发生的机制做了一些新的研究。

已知活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）能够损伤脂质蛋白及DNA，因此会转变信号通路并影响基因表达、细胞粘附、细胞代谢及细胞凋亡等相关过程。Jung和Kim[28]研究发现HBx C末端区域对ROS合成及8-氧鸟嘌呤形成至关重要。HBx C末端区域能够诱导ROS产生，增加机体氧化压力导致线粒体DNA损伤，可能对HCC发生起重要作用，也间接说明HBx可能与HCC发生相关。C末端截短HBx，尤其是C末端截短24氨基酸HBx蛋白可通过氨基酸激酶信号途径活化金属蛋白酶10增强细胞的侵袭力和转移，这可能是C末端截短HBx促进HCC发生的机制之一[29]。微小RNA（microRNA,miRNA）可能参与了HCC发生过程：一项研究发现截短HBx能够降低一系列具有生长抑制功能miRNAs的表达，间接促进肝细胞增殖，提示HBV C末端截短HBx可能通过下调miRNA途径诱导HCC发生[30]。另外，Lee等[31]从HBV携带者中分离出2种HBx，一种为在第31丝氨酸位点含有磷酸化的蛋白激酶B（HBx-S31），具有抗凋亡作用；另一种为不包含磷酸化的蛋白激酶B（HBx-L31），具有促凋亡作用。功能学研究发现HBx-S31促进肿瘤的生长，而HBx-L31抑制肿瘤的生长。已知缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）-1a有助于HCC的发生和发展。研究证实不同突变HBx对HIF-1a功能产生不同影响，总体水平上突变HBx蛋白增强HIF-1a表达水平，可能间接促进HCC发生[32]。

HBx与pre-S2突变蛋白的共同表达具有更强致癌作用。体外研究发现共同表达HBx和pre-S2突变蛋白的肝细胞能够增强血管内皮生长因子A、磷酸化蛋白激酶B-1/2/3、胞外信号调节激酶1/2及雷帕霉素哺乳动物靶点。动物实验发现含有HBx及pre-S突变质粒的转基因小鼠平均15.1个月发展到HCC，比仅含有HBx突变蛋白转基因小鼠（16.9个月）和仅含有pre-S2突变蛋白转基因小鼠（24.5个月）经历时间短。这表明在HBV慢性感染中2种突变蛋白的共同表达可能会增强致癌性[33]。

5小结与展望

慢性HBV感染是导致HCC发生风险增大的主要因素。HBV基因4个部分重叠开放阅读框内的多种HBV基因突变与HCC的发生密切相关，可作为预测HCC发生的生物学指标。HBV基因突变可通过多种机制促进HCC发生，包括突变蛋白、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白结合，促进细胞的增殖，导致染色体不稳定，突变蛋白分泌障碍，可造成内质网应激引起细胞内活性氧族增加，突变基因易于整合到宿主染色体造成后者不稳定，突变蛋白降低了病毒抗原表达或抗原表位亲和力，进而促使感染细胞逃逸免疫监视等。要完全阐明HBV基因突变在HCC发生发展中的作用，还须进行临床前瞻性的大样本队列研究，在细胞和动物模型上进行更深入的功能学实验。

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence andmortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］.Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[2]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3]Yang H,Yuen M,Chan HL,et al.Risk estimation for hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B(REACH-B):development and validation of a predictive score［J］.Lancet Oncol,2011,12 (6):568-574.

[4]Liu S,Zhang H,Gu C,et al.Associations between hepatitis B virus mutations and the risk of hepatocellular carcinoma:a metaanalysis［J］.J Natl Cancer Inst,2009,101(15):1066-1082.

[5]Wang C,Teng Z,Zhu Y,et al.Associations between pre-S deletion mutation of hepatitis B virus and risk of hepatocellular carcinoma in the Asian population:a meta-analysis［J］.Med Sci Monit, 2015,21:1072-1077.

[6]Qu L,Liu J,Liu T,et al.Association of hepatitis B virus pre-S deletions with the development of hepatocellular carcinoma in Qidong,China［J］.PLoS One,2014,9(5):e98257.

[7]秦雅群，李晓东，廖昊，等.慢性HBV感染者不同病程阶段HBV前S基因缺失突变的比较分析［J］.传染病信息，2015，28(2): 79-82.

[8]Abe K,Thung SN,Wu HC,et al.Pre-S2 deletion mutants of hepatitis B virus could have an important role in hepatocarcinogenesis in Asian children［J］.Cancer Sci,2009,100(12):2249-2254.

[9]Huang HP,Hsu HY,Chen CL,et al.Pre-S2 deletions of hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma in children［J］.Pediatr Res, 2010,67(1):90-94.

[10]Wang HC,Chang WT,Chang WW,et al.Hepatitis B virus pre-S2 mutant upregulates cyclin A expression and induces nodular proliferation of hepatocytes［J］.Hepatology,2005,41(4):761-770.

[11]Wang LH,Huang W,Lai MD,et al.Aberrant cyclin A expression and centrosome overduplication induced by hepatitis B virus pre-S2 mutants and its implication in hepatocarcinogenesis［J］.Carcinogenesis,2012,33(2):466-472.

[12]Mun HS,Lee SA,Kim H,et al.Novel F141L pre-S2 mutation in hepatitis B virus increases the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic genotype C infections［J］.J Virol,2011,85 (1):123-132.

[13]Wu Y,Gan Y,Gao F,et al.Novel natural mutations in the hepatitis B virus reverse transcriptase domain associated with hepatocellular carcinoma［J］.PLoS One,2014,9(5):e94864.

[14]Li L,Liu W,Chen YH,et al.Antiviral drug resistance increases hepatocellular carcinoma:a prospective decompensated cirrhosis cohort study［J］.World J Gastroenterol,2013,19(45):8373-8381.

[15]Yeh CT,Chen T,Hsu CW,et al.Emergence of the rtA181T/ sW172*mutant increased the risk of hepatoma occurrence in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B［J］.BMC Cancer,2011,11:398.

[16]Warner N,Locarnini S.The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA181T/sW172*mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound［J］.Hepatology,2008,48(1):88-98.

[17]Liao Y,Hu X,Chen J,et al.Precore mutation of hepatitis B virus may contribute to hepatocellular carcinoma risk:evidence from an updated meta-analysis［J］.PLoS One,2012,7(6):e38394.

[18]Li MS,Lau TC,Chan SK,et al.The G1613A mutation in the HBV genome affects HBeAg expression and viral replication through altered core promoter activity［J］.PLoS One,2011,6(7):e21856.

[19]Tatsukawa M,Takaki A,Shiraha H,et al.Hepatitis B virus core promoter mutations G1613A and C1653T are significantly associated with hepatocellular carcinoma in genotype C HBV-infected patients［J］.BMC Cancer,2011,11:458.

[20]Bai X,Zhu Y,Jin Y,et al.Temporal acquisition of sequential mutations in the enhancer II and basal core promoter of HBV in individuals at high risk for hepatocellular carcinoma［J］.Carcinogenesis,2011,32(1):63-68.

[21]Park YM,Jang JW,Yoo SH,et al.Combinations of eight key mutations in the X/preC region and genomic activity of hepatitis B virus are associated with hepatocellular carcinoma［J］.J Viral Hepat,2014,21(3):171-177.

[22]Chu CM,Lin CC,Chen YC,et al.Basal core promoter mutation is associated with progression to cirrhosis rather than hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B virus infection［J］.Br J Cancer, 2012,107(12):2010-2015.

[23]Huang Y,Tong S,Tai AW,et al.Hepatitis B virus core promoter mutations contribute to hepatocarcinogenesis by deregulating SKP2 and its target,p21［J］.Gastroenterology,2011,141(4):1412-1421.

[24]Huang Y,Tai AW,Tong S,et al.HBV core promoter mutations promote cellular proliferation through E2F1-mediated upregulation of S-phase kinase-associated protein 2 transcription［J］.J Hepatol,2013,58(6):1068-1073.

[25]Zheng JX,Zeng Z,Zheng YY,et al.Role of hepatitis B virus base core and precore/core promoter mutations on hepatocellular carcinoma in untreated older genotype C Chinese patients［J］.J Viral Hepat,2011,18(10):e423-e431.

[26]Kim DW,Lee SA,Hwang ES,et al.Naturally occurring precore/ core region mutations of hepatitis B virus genotype C related to hepatocellular carcinoma［J］.PLoS One,2012,7(10):e47372.

[27]Kim CM,Koike K,Saito I,et al.HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice［J］.Nature,1991,351(6324): 317-320.

[28]Jung SY,Kim YJ.C-terminal region of HBx is crucial for mitochondrial DNA damage［J］.Cancer Lett,2013,331(1):76-83.

[29]Sze KM,Chu GK,Lee JM,et al.C-terminal truncated hepatitis B virus x protein is associated with metastasis and enhances invasiveness by C-Jun/matrix metalloproteinase protein 10 activation in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology,2013,57(1):131-139.

[30]Yip WK,Cheng AS,Zhu R,et al.Carboxyl-terminal truncated HBx regulates a distinct microRNA transcription program in hepatocellular carcinoma development［J］.PLoS One,2011,6(8):e22888.

[31]Lee WP,Lan KH,Li CP,et al.Pro-apoptotic or anti-apoptotic property of X protein of hepatitis B virus is determined by phosphorylation at Ser31 by Akt［J］.Arch Biochem Biophys,2012,528 (2):156-162.

[32]Liu LP,Hu BG,Ye C,et al.HBx mutants differentially affect the activation of hypoxia-inducible factor-1α in hepatocellular carcinoma［J］.Br J Cancer,2014,110(4):1066-1073.

[33]Wu HC,Tsai HW,Teng CF,et al.Ground-glass hepatocytes coexpressing hepatitis B virus X protein and surface antigens exhibit enhanced oncogenic effects and tumorigenesis［J］.Hum Pathol, 2014,45(6):1294-1301.

（2015-08-21收稿 2015-09-10修回）

（责任编委 张玲霞 本文编辑 陈玉琪）

Research progress of the relationship between HBV mutations and occurrence of hepatocellular carcinoma

NIAN Xue-yuan,XU Zhi-hui,LIU Yan,XU Dong-ping*
Research Center for Clinical Medicine,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China

HBV infection is the main etiologic factor for occurrence of hepatocellular carcinoma(HCC),accounting for more than 50％of the cases.Therefore,prevention and treatment of HBV infection has become a hot issue in the world.The HBV mutations, which include point mutation,deletion,insertion and truncation in 4 open reading frames(S,C,P,and X)are suggested to be associated with HCC pathogenesis.Some mutations related with aggravation of hepatitis B may serve as a biomarker to predict HCC occurrence. Some mutant HBV antigens may directly or indirectly regulate cell cycle,apoptosis,and other related proteins,which promote cell proliferation and chromosome instability and therefore increase the risk of HCC occurrence.

hepatitis B virus;carcinoma,hepatocellular;mutation

R373.21；R735.7

A

1007-8134(2015)05-0000-00

国家自然科学基金（81373136、81271847）

100039北京，解放军第三〇二医院临床研究管理中心（粘学渊、许智慧、刘妍、徐东平）

徐东平，E-mail:xudongping302@sina.com

*Corresponding author,E-mail:xudongping302@sina.com