HPLC法测定枇杷叶中一种橙花叔醇苷的含量

张红茹，孙 琳

(1.天津中医药大学，天津 300193； 2.天津中新药业研究中心，天津 300457)



HPLC法测定枇杷叶中一种橙花叔醇苷的含量

张红茹1,2，孙 琳2

(1.天津中医药大学，天津 300193； 2.天津中新药业研究中心，天津 300457)

目的：建立HPLC法测定枇杷叶中倍半萜苷—橙花叔醇苷的含量。方法：采用HPLC法测定，色谱柱为Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(29∶71)；体积流量1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm。结果：倍半萜苷在0.009 629～2.006 μg/ml(r=0.999 6)范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为96.23%。结论：该方法操作简单，结果准确，专属性好，可用于枇杷叶的质量控制。

枇杷叶,倍半萜苷,橙花叔醇苷,含量测定,HPLC

枇杷叶Eriobotryaefolium为蔷薇科植物枇杷的干燥叶，具有清肺止咳，降逆止呕的功效，用于治疗肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴[1]。枇杷叶的化学成分主要有三萜酸类、倍半萜及其苷类、多酚类、黄酮类以及糖苷类，具有抗炎止咳、抗病毒、降血糖和抗肿瘤等药理活性[2]。

目前报道的枇杷叶含量测定成分以齐墩果酸、熊果酸等三萜酸类多见[3-5]，也有苦杏仁苷、绿原酸、槲皮素和山奈酚等[6-8]。《中国药典》中其含量测定是以熊果酸和齐墩果酸的三萜酸类为质控指标，但此成分在众多植物如山楂、女贞子、白花蛇舌草中均有存在且含量较高[9]，故其作为质控指标专属性较低。本文旨在对枇杷叶中橙花叔醇-3-O-{α-1-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}进行HPLC法测定及方法学考查，以建立该倍半萜苷橙花叔醇苷的含量测定方法，因其为枇杷叶的特征成分，在枇杷叶中比上述其他成分更具专属性，可作为枇杷叶质量控制指标的有效补充，为质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相色谱仪(Waters公司)；AL204-IC型万分之一天平(Mettler公司)；HU10260B型超声仪(天津恒奥科技有限公司)。

1.2 试药 枇杷叶药材(批号Y-1211-0149，Y-1406-0113，140501,购自天津中新药业集团股份有限公司药材分公司)；橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}(实验室自制，纯度≥98%，以下称为橙花叔醇苷)；乙腈(色谱纯，天津康科德科技有限公司)；水为纯净水(Millipore纯水机制备)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相乙腈-水(29∶71)；检测波长210 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 ml/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取橙花叔醇苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成0.1 mg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取枇杷叶粉末(批号Y-1211-0149，过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇25 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件分析，结果见图1。

1.橙花叔醇苷

2.4 线性关系考查 分别精密吸取浓度为0.009 628 8、0.032 096、0.080 24、0.160 48、0.401 2、0.802 4和2.006 mg/ml的对照品溶液各10 μl，按照“2.1”项下色谱条件分析，测定峰面积，记录数据。以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程Y=3 700 000X+20 494(r=0.999 6)，结果表明橙花叔醇苷在0.009 629～2.006 mg/ml浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，按照“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定其色谱峰的峰面积，计算RSD为0.52%，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同批枇杷叶样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、15、18 h进样10 μl，测定其色谱峰的峰面积，计算RSD为1.10%，说明供试品溶液在0～18 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同批枇杷叶样品6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算质量分数的RSD为0.56%，说明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品0.25 g，加入一定量的对照品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述测定方法进行测定，计算回收率，结果平均回收率为96.23%，RSD为1.20%，结果见表1。

表1 橙花叔醇苷加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定 取3批枇杷叶，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定橙花叔醇苷的含量，测定结果见表2。

表2 样品测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本实验采用二极管阵列检测器进行200～400 nm全谱测定，结果橙花叔醇苷在紫外光谱中只具末端吸收，为减少溶剂及杂质干扰，故选择210 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择 由于甲醇、甲酸和乙酸等溶剂在210 nm附近均有紫外吸收，对本成分的测定会有干扰，故选择乙腈水作为流动相，通过流动相比例及不同色谱柱的考查，最终确定了基线平稳，峰形较好，保留时间适中的流动相系统。

3.3 提取溶剂和方法的选择 在实验过程中考查了分别以100%、70%、50%甲醇及水饱和正丁醇超声提取，结果表明70%、50%甲醇及水饱和正丁醇提取率相当，但70%、50%甲醇提取杂质较多，故选择水饱和正丁醇作为提取溶剂。又考查了以水饱和正丁醇为溶剂超声和加热回流的提取情况，结果表明超声提取30 min即可提取完全。

枇杷叶中倍半萜苷—橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}是由意大利学者De Tommasi等[10]从枇杷叶中首次分离得到，并证实其有降低血糖的作用[11]。其苷元橙花叔醇也是枇杷叶中挥发油的主要成分[12]，具有抗菌作用[13]，与枇杷叶已知疗效相关，橙花叔醇苷有可能在体内代谢为橙花叔醇，间接发挥疗效，但还需进一步证实。目前枇杷叶含量测定的指标成分多为三萜酸类，但中药常用水提或水煎煮后服用，使用脂溶性很强的熊果酸等三萜酸类显然不太合理，本文建立水溶性的橙花叔醇苷含量测定的方法，以橙花叔醇苷作为枇杷叶的质控指标，可以更合理的控制其质量。

1 中国药典[S]. 一部.2010：190-191

2 陆林博. 枇杷叶的化学成分研究[D]. 南京师范大学,2006：10-12

3 陈龙胜,忻旸,许舒雯. RP-HPLC同时测定枇杷叶中4种三萜酸[J]. 中草药,2008,39(9):1411-1413

4 蔡雪萍,李振华,华俊磊，等. 一测多评法测定枇杷叶有效部位中6种三萜酸成分的量[J]. 中草药,2013,44(21):3057-3062

5 Zhang Y, Xue K, Zhou A,etal.Determination of triterpenoic acid isomers in Eriobotryae folium using high performance liquid chromatography on C30 column[J]. Chinese journal of chromatography,2014,32(1):47-51

6 庄永峰. 高效液相色谱法测定枇杷叶中苦杏仁苷含量[J]. 海峡药学,2002,14(5):64-65

7 张丽贤,周光明,姜兰芳,等. 非离子表面活性剂萃取-高效液相色谱法测定枇杷叶中的绿原酸、槲皮素和山奈酚[J]. 食品科学,2012,33(6):150-153

8 孟令军,李超生,孟庆繁,等. 高效液相色谱法测定枇杷叶药材中绿原酸的含量[A]. 吉林省科学技术协会.吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C],2008:22-23

9 相延英,杨光. 常用中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[J]. 中国医院药学杂志,2004,24(5):61-63

10 De Tommasi N,De Simone F,Aquino R,etal.Plant Metabolites.new sesquiterpene glycosides from Eriobotrya japonica[J]. Journal of Natural Products，1990,53(4):810-815

11 De Tommasi N,De Simone F,Cirino G,etal. Hypoglycemic effects of sesquiterpene glycosides and polyhydroxylated triterpenoids of Eriobotrya Japonica[J].Planta Med,1991,57(5)：414

12 郭宇,吴松吉,朴惠善. 枇杷叶的化学成分及药理活性研究进展[J]. 时珍国医国药,2006,17(6):928-930

13 陶冉,王成章,孔振武. 银杏叶类脂成分与聚戊烯醇的协同抑菌作用[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(17):203-210

Determination of nerolidol glycosides inEriobotryaefoliumby HPLC

Zhanghongru1,2，Sunlin2

(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193；2.Tianjin Zhongxin Pharmaceuticals R&D Center,Tianjin 300457)

Objective： To establish an HPLC method for determination of a sesquiterpene glycosides-nerolidol glycosides inEriobotryaefolium.Methods： HPLC was applied with the chromatographic condition as follows:The chromatographic column was Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)at 30 ℃;acetonitrile-water(29∶71) as the mobile phase;flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 210 nm.Results： Linear relationships was 0.009 629～2.006 μg(r=0.999 6),the average recovery was 96.23%.Conclusion： The method is convenient,accurate and specific,can be applied to the quality control ofEriobotryaefolium.

Eriobotryaefolium，sesquiterpene glycosides，nerolidol glycosides，quantitative determination，HPLC

2015-03-17

R927.2

A

1006-5687(2015)03-0009-03