甘肃冬小麦品种(系)面筋强度、黄色素含量和PPO活性相关基因的分子检测

周喜旺，宋建荣，岳维云，张耀辉，曹世勤，吕莉莉，刘鸿燕，

王娜1，南海1，赵尚文1

(1.甘肃省天水市农业科学研究所，甘肃 天水　741000； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州　730070)

甘肃冬小麦品种(系)面筋强度、黄色素含量和PPO活性相关基因的分子检测

周喜旺1，宋建荣1，岳维云1，张耀辉1，曹世勤2，吕莉莉1，刘鸿燕1，

王娜1，南海1，赵尚文1

(1.甘肃省天水市农业科学研究所，甘肃 天水741000； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州730070)

摘要：为了明确甘肃冬小麦品种(系)中品质相关基因的分布状况，提高品质育种效率，以141份小麦品种(系)为材料，利用高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5的特异PCR标记、与黄色素含量相关的八氢番茄红素合酶(phytoene synthase,Psy)基因Psy-A1的标记YP7A及多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性基因Ppo-A1的标记PPO18分别进行1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1的基因型检测.结果表明：含1Dx5基因的材料56份，分布频率为39.7%；Psy-A1位点存在Psy-A1a和Psy-A1b 2种等位变异类型，分布频率分别为62.4%和37.6%；Ppo-A1位点存在Ppo-A1a和Ppo-A1b 2种等位变异类型，分布频率分别为42.6%和57.4%.1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1的基因类型在不同地区分布频率存在明显差异，1Dx5和Psy-A1b基因在天水地区频率最高，分别为51.0%和40.8%；Ppo-A1b基因在庆阳地区频率最高，为77.8%，Psy-A1a基因在3地区的分布频率明显高于Psy-A1b基因.参试材料中，聚合1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因的材料有19份，这些材料可作亲本资源，在小麦品种面筋强度和面粉色泽的改良中加以利用.

关键词：普通小麦；1Dx5；黄色素；多酚氧化酶活性；分子检测

第一作者：周喜旺(1978-)，女，助理研究员，研究方向为小麦遗传育种.E-mail:zhouxiwang1208@163.com

Molecular detection of genes associated with gluten strength,

yellow pigment content and PPO activity of winter

wheat cultivars (lines) in Gansu Province

ZHOU Xi-wang1,SONG Jian-rong1,YUE Wei-yun1,ZHANG Yao-hui1,CAO Shi-qin2,

LYU Li-li1,LIU Hong-yan1,WANG Na1,NAN Hai1,ZHAO Shang-wen1

(1.Tianshui Institute of Agricultural Sciences,Tianshui 741000,China;2.Institute of Plant Protection,

Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In order to define the distribution of genes related to quality traits and improve breeding efficiency,3 gene specific markers for HMW-GS 1Dx5,Psy-A1 and Ppo-A1 genes were used to detect the allelic variations at these loci in 141 Gansu wheat cultivars and advanced lines.The results indicated that the frequency of 1Dx5 gene was 39.7%,the frequencies of Psy-A1a genotype with high yellow pigment content and Psy-A1b genotype with low yellow pigment content at Psy-A1 locus were 62.4% and 37.6%,respectively;the frequencies of Ppo-A1a genotype with high PPO activity and Ppo-A1b genotype with low PPO activity at Ppo-A1 locus were 42.6% and 57.4%,respectively.Significant differences among 1Dx5,Psy-A1 and Ppo-A1 were found in different areas,1Dx5 and Psy-A1b were distributed mainly in Tianshui area,with frequency of 51.0% and 40.8%,respectively;Ppo-A1b had highest frequency of 77.8% in Qingyang area.The frequency of Psy-A1a was obviously higher than that of Psy-A1b in three areas.19 materials contented desired gene for 1Dx5 and alleles for Psy-A1b and Ppo-A1b,thus it is essential to combine the desired genes in a variety to improve the processing quality of Gansu winter wheat.The markers used in this study were all gene-specific,with good stability and high accuracy,and they can be efficiently applied in molecular marker-assisted breeding for wheat quality improvement.

Key words：common wheat;1Dx5;yellow pigment;polyphenol oxidase activity;molecular detection

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，近年来，随着人们生活水平的日益提高，消费者对小麦品质提出了更高的要求，目前，国内外已将品质改良作为小麦育种的重要目标之一.

高分子量麦谷蛋白亚基对面团粘弹性有重要影响[1-2].Glu-D1位点等位基因1Dx5+1Dy10编码的5+10亚基与高面筋强度密切相关，是所有高分子量麦谷蛋白亚基中对面包烘烤品质贡献最大的亚基[3].目前，Ovidio[4]等和Smith[5]等已分别开发了1Dx5和1Dy10位点特异的PCR标记，由于1Dx5和1Dy10紧密连锁，可利用1Dx5基因的标记检测来判断5+10亚基的有无.黄色素是小麦籽粒中最重要的天然素，有研究报道小麦籽粒黄色素含量与面制食品的白度呈高度负相关[6]，与面团黄度的相关系数高达0.8～0.9[7].Miskelly等[8]研究表明，黄色素含量主要受基因型控制，遗传力为0.68.Parker等[9]、Elouafi等[10]研究表明，黄色素含量受多个基因位点的调控，但位于第7同源群上的QTL效应最大.He等[11]克隆了位于小麦7A染色体上的基因Psy-A1，并开发出相应的功能标记YP7A，此标记能较好地区分7AL染色体上控制黄色素含量高、低的等位基因Psy-A1a和Psy-A1b.研究发现，多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)催化的化学反应是引起面团或面条颜色变褐的主要原因[12]，从而影响面制品的外观品质和营养价值[13-14].面粉中PPO的含量虽仅占籽粒中总PPO含量的3%[15]，但可以解释面制品颜色变异的50%～70%[16]，通过遗传育种途径选择低PPO活性的小麦品种是改良小麦面制食品颜色变褐的主要措施.张立平等[17]发现染色体2AL和2DL上存在控制PPO活性的主效QTL，其贡献率分别为37.9%～50.0%和25.0%～29.1%.Sun 等[18]开发出了位于2AL染色体上的功能标记PPO18.此标记能有效区分小麦2AL染色体上控制高、低PPO活性的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b.以上特异标记的开发，为小麦种质资源及品种(系)中相关基因的快速、准确检测提供了可能.

目前，国内学者利用上述标记，并取得了较好的研究结果.但以甘肃冬小麦品种(系)为试验材料进行品质性状方面检测尚未见报道.基于此，作者选用部分甘肃冬小麦品种(系)进行品质性状相关基因的分子检测，旨在明确研究材料所含的基因种类及其相关品质状况，筛选有价值的小麦种质，为小麦品质育种提供亲本材料；并进一步验证相关标记的有效性和实用性，以期利用分子标记辅助选择技术加快小麦品质改良的步伐.

1材料与方法

1.1供试材料

试验所用141份小麦品种和育成新品系的名称和来源见附表1，由甘肃省天水市农业科学研究所小麦中心提供.每份材料选取籽粒饱满种子，播种于直径9 cm的黑色营养钵内，2叶1心期采集新鲜叶片用于基因组DNA的提取.

1.2基因组DNA的提取

参考文献[19-20]用CTAB法提取小麦基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA质量及浓度，并稀释到50 ng/μL.

1.3特异性分子标记

1Dx5的特异PCR标记及YP7A、PPO18标记的引物序列及相关信息见表2，所用引物由北京赛百盛公司合成.

1.4PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR扩增及凝胶电泳所用试剂均购于北京天根生化科技公司.1Dx5、YP7A和PPO18标记的PCR反应体系均为10 μL，其中2 μL ddH2O、5 μL 2×MasterMix、上下游引物各1 μL、模板DNA(50 ng/μL)1 μL.3个标记的扩增程序分别参照表1相关文献，略有改动.1Dx5的扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min.YP7A的扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min.PPO18的扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min.扩增产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用缓冲体系为1×TBE溶液，电压180 V，扩增产物电泳1 h，银染显色后，置于白炽灯箱上用数码相机拍照.

表1　甘肃141份小麦品种(系)品质性状相关基因分子检测结果

“+”表示检测到1Dx5基因，“-”：表示未检测到1Dx5基因； YP7A检测到194 bp片段，以“1”表示，231 bp片段，以“2”表示；PPO18检测到685 bp片段，以“1”表示，876 bp片段，以“2”表示.

表2　用于检测品质性状相关基因的分子标记及其引物序列

2结果与分析

2.11Dx5基因检测结果

1Dx5基因的特异PCR标记是显性标记，含该基因的材料，可扩增得到450 bp的特异片段，不含1Dx5基因的材料，无此片段.从图1可以看出，利用PCR标记，在电泳图谱450 bp的位置上，可明显区分供试材料中1Dx5基因的有无.在141份材料中，有56份材料含有该基因，占参试材料的39.7%.

M:分子量标准;1:‘天选43号’;2:‘天选45号’;3:‘天选46号’;4:‘中梁12号’;5:‘兰天7号’;6:‘ 兰天23号’;7:‘中梁14号’;8:‘兰天24号’;9：‘西峰25号’;10:‘天S98531’.

图11Dx5基因特异PCR标记对部分材料的扩增结果

Fig.1PCR amplification in partial varieties with

1Dx5 specific PCR marker

2.2Psy-A1位点的等位变异

采用共显性标记YP7A，对供试材料Psy-A1位点的等位基因Psy-A1a和Psy-A1b进行检测(图2)，分别扩增得到194 bp和231 bp大小的片段.在141份材料中，含Psy-A1a等位基因的材料有88份，占62.4%；含Psy-A1b等位基因的材料有53份，占37.6%.表明甘肃省冬小麦品种(系)的Psy-A1位点上广泛存在Psy-A1a和Psy-A1b2种等位变异类型.

M:分子量标准;1:‘中梁27号’;2:‘天选43号’;3:‘中梁14号’;4:‘中梁23号’;5:‘天选46号’;6:‘陇鉴9811’;7:‘兰天9号’;8:‘ 兰天11号’;9:‘天S98531’;10:‘兰天7号’.

图2利用YP7A检测部分材料中的Psy-A1等位变异

Fig.2Identification of Psy-A1 locus in partial

varieties with YP7A

2.3Ppo-A1位点的等位变异

利用共显性标记PPO18，对供试材料Ppo-A1位点的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b进行检测(图3)，分别扩增得到685 bp和876 bp大小的片段.在141份材料中，含Ppo-A1a等位基因的材料有60份，占42.6%；含Ppo-A1b等位基因的材料有81份，占57.4%.表明甘肃省冬小麦品种(系)的Ppo-A1位点上广泛存在Ppo-A1a和Ppo-A1b2种等位变异类型.

M:M:分子量标准;1:‘中梁12号’;2:‘中梁23号’;3:‘中梁14号’;4:‘天选46号’;5:‘兰天2号’;6:‘兰天3号’;7:‘兰天25号’;8:‘陇原011’;9:‘西峰25号’.

图3利用PPO18检测部分材料中的Ppo-A1等位变异

Fig.3Identification ofPpo-A1 locus in partial

varieties withPPO18

2.4聚合优异基因材料的筛选

在所有参试材料中，既含有低黄色素含量等位基因Psy-A1b，又含有低多酚氧化酶活性等位基因Ppo-A1b，同时含有1Dx5基因的材料有19份(‘天选43’‘天选45’‘天选48’‘天选49’‘天03-165-2’‘天S98531’‘S98530-7-2-2-1-1-1’‘03-165-6-1’‘01-61-4-2-1-1-1’‘S98531-1-1-1-2’‘99211-1-1-4-1’‘9474-1-1-5-2-1-2c2’‘05495-34-5-1-4’‘0817-4’‘0741-1-14’‘05184-1-1-4’‘08531-15’‘96289’‘99293’)，说明甘肃冬小麦品种(系)中，聚合多个优良品质性状基因的品种(系)不是很多，小麦品质改良工作急需加强.

2.5不同地区1Dx5、Psy-A1及Ppo-A1基因类型分布

从表3可以看出，1Dx5、Psy-A1和Ppo-A1基因在不同地区分布频率存在明显差异，1Dx5和Psy-A1b基因主要分布在天水地区，频率分别为51.0%和40.8%，Psy-A1a基因在3个地区的分布频率明显高于Psy-A1b基因；Ppo-A1a基因在兰州地区分布频率最高，为55.9%，Ppo-A1b基因在庆阳地区分布频率最高，为77.8%.

表2　不同地区被测基因等位变异分布频率

3讨论与结论

基因功能标记的开发与应用是小麦分子育种的重要方向[21].基于PCR技术，本研究检测的141份材料中，发现1Dx5基因的分布频率为39.7%，与王静等[22]、徐相波等[23]的研究结果16.3%和34.7%基本一致，但远低于国外的基因频率(约85%)[24]，这也与目前甘肃省冬小麦育种中仅重视抗条锈育种，尚不重视品质育种有很大关系.研究发现，本试验中低黄色素含量等位基因Psy-A1b的分布频率为37.6%，与杨芳萍等[21]研究的国内主要冬麦区的历史品种和当前主栽品种、胡凤灵等[25]研究的中国不同地区的221份小麦品种中Psy-A1b分布频率分别为37.8%和36.6%的结果基本一致，表明甘肃乃至中国大部分冬小麦品种(系)的黄色素含量高，不符合中国传统食品馒头、面条的白度要求，降低小麦品种黄色素含量是小麦品质育种的重要目标.多酚氧化酶活性检测结果发现，等位基因Ppo-A1b的分布频率为57.4%，略高于全国平均水平(52%)[15]，高于张春利等[26]对黑龙江省小麦品种的研究结果(41.2%)，略低于肖永贵等[27]对中国冬小麦品种的检测结果(58.2%)，表明尽管甘肃省冬小麦在品质育种方面没有针对Ppo-A1基因进行定向选择，但Ppo-A1b的分布频率不是很低，选择潜力大，有利于培育符合甘肃传统食品面条、馒头所需的低多酚氧化酶活性的品种，提高甘肃小麦面粉的白度.

通过对甘肃省141份冬小麦品种(系)1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因等位变异分析，各基因在不同地区分布频率存在明显差异.1Dx5、Psy-A1b基因主要分布在天水地区，Ppo-A1b基因在庆阳地区分布频率最高，这可能与各地区所用亲本及育种方向不同有关.综合来看，供试材料中，聚合有1Dx5、Psy-A1b和Ppo-A1b基因的品种(系)有19份，且全为甘肃天水地区材料，在甘肃兰州和庆阳地区的材料中未检测到聚合3个基因的品种(系)，今后小麦品质育种要以聚合多个优良品质性状基因为重点，同时借助分子标记技术加快小麦品质改良的步伐.

由于小麦籽粒黄色素含量和多酚氧化酶活性分别受多个基因位点的调控，仅考虑某一位点的基因型并不能准确评价真实的黄色素含量和多酚氧化酶活性.本研究对甘肃冬小麦品种(系)从Psy-A1和Ppo-A1位点初步进行了基因型鉴定，下一步要做的工作应该是对黄色素含量和多酚氧化酶活性的另外位点进行基因型鉴定及不同位点基因组合方式做深入研究.

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(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-24；修回日期：2014-06-11

基金项目：国家自然科学基金项目(31160362)；甘肃省生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2010-24).

通信作者：宋建荣，男，研究员，研究方向为小麦遗传育种.E-mail:tskd228202@163.com

中图分类号：S 512.1+1

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)02-0054-07