‘李广杏’幼胚的离体培养

胡紫璟，毛娟，赵长增，陈佰鸿，王玉安，赵双

(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州　730070；2.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州　730070)

‘李广杏’幼胚的离体培养

胡紫璟1，毛娟1，赵长增1，陈佰鸿1，王玉安2，赵双1

(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州730070)

摘要：以‘李广杏’幼胚(盛花后30～40 d)为试验材料，MS为基本培养基，研究了激素及其不同浓度组合对幼胚萌发和胚培苗继代增殖的影响.结果表明：幼胚萌发的适宜培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L，在培养20 d时萌发率达到100%，子叶生长健壮，叶片浓绿伸展；胚培苗继代增殖的适宜培养基配方为MS + 6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L，增殖系数达3.42.

关键词：‘李广杏’；6-BA；IAA；幼胚离体培养

第一作者：胡紫璟(1989-)，女，硕士研究生，研究方向为果树生物技术.E-mail:107331302294@st.gsau.edu.cn

Immature embryo culture on apricot variety

‘Liguangxing’invitro

HU Zi-jing1,MAO Juan1,ZHAO Chang-zeng1,CHEN Bai-hong1,WANG Yu-an2,ZHAO Shuang1

(1.College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Fruit and

Floriculture Research,Gansu Academy of Agriculture Sciences,Lanzhou 730070 China)

Abstract：The experiment studied the effects of various plant growth regulators and their different concentration combinations on immature embryo germination and embryo seedlings subculture proliferation of apricot variety Liguangxing.Using young embryos (30 d to 40 d after full blooming) were used as experimental materials and MS was the basic medium.The result indicated that the immature embryo grew well on MS+6-BA 0.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L medium during its primary culture.Under this processing,the germination rate reached 100% at 20 th day,cotyledons grew strongly,leaves dark green and stretch.The suitable subculture medium of immature embryos is MS + 6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.05 mg/L.Under this treatment,the propagation coefficient reached 3.42.The techniques of immature embryo culture of apricot variety ‘Liguangxing’ in vitro are established in this study,which lay a foundation for its cross breeding and genetic transformation.

Key words：apricot variety ‘Liguangxing’;6-BA;IAA;immature embryo culture in vitro

胚培养是果树育种中克服自交不亲合以及杂种胚早期败育的主要技术之一[1-3]，是直接应用于植物改良最早的组织培养技术.核果类果树胚培养始于1933年Tukey对樱桃的胚培养[4]，之后已成功的运用于桃、杏、枣等果树中，在果树育种中极具优势.‘李广杏’是蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(ArmeniacaMill)植物[5]，又名包仁杏，是甘肃敦煌的优质地方资源品种，以其果实外形规正，果大赛李，果皮金黄色，色泽油光鲜亮，皮薄肉多核小，味美汁多，香气四溢等优良性状深受消费者的喜爱.但是，‘李广杏’栽培种中存在严重的雌蕊败育及晚霜危害等因素，使其常规杂交育种相对困难，进程较为缓慢[6]，远缘杂交和转基因育种为解决这一问题提供了新途径.本试验选取6-BA、IAA、IBA、ZT 4种植物激素，优化和建立了‘李广杏’幼胚培养体系，以期为‘李广杏’远缘杂交和利用基因工程进行品种改良奠定研究基础.

1材料与方法

1.1材料采集

‘李广杏’采自甘肃省农科院杏品种园，取盛花后30～40 d的果实(图1)，果肉较少，果核半木质化，剥去果肉后，砸开果核并小心的取出种子放入已消毒的三角瓶中，作为胚培养的材料.

图1　杏盛花后30～40 d的果实

1.2培养基与培养条件

试验以MS为基本培养基，添加蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH6.0.幼胚萌发诱导培养基为：6-BA与ZT分别设0、0.5、1.0 mg/L 3个水平，IAA与IBA分别设0、0.2 mg/L 2个水平分别组合进行试验，共10个处理，CK为不添加任何激素的处理.胚培苗的继代增殖培养基为6-BA，设0.5、1.0 mg/L 2个水平，IAA设0、0.05、0.10 mg/L 3个水平进行组合试验，共6个处理.

培养条件：培养温度为(25±2) ℃；光照强度为2 500～3 000 lx；光周期为16 h/8 h.

1.3幼胚培养方法

1.3.1幼胚材料的准备接种前将种子在自来水下冲洗30 min，沥干水分，在超净工作台上用70 %乙醇浸泡30 s，再用0.1% 升汞表面消毒7 min，最后用无菌水冲洗4～5次，用解剖针和手术刀切开种子，挑出种胚后接种到预先准备好的培养基上.

1.3.2幼胚诱导萌发培养每个处理4个重复，接种后观察培养过程中胚的发育状况，分别记录10、20、30 d时的萌发数及30 d后的胚培苗平均高度，计算萌发率.

萌发率(%)=萌发的胚数/接种的胚数×100%

1.3.3胚培苗的继代增殖增殖培养时先将胚培苗在MS基本培养基上壮苗15 d后，选取长势、苗高等指标基本一致的胚培苗作为增殖培养的材料.每个处理接种10瓶，每瓶接1个胚培苗.增殖培养后观察其生长情况，培养30 d后统计各处理的出苗总数，计算增殖系数[7].

增殖系数=出苗总株数/接种株数

1.4数据处理

试验数据使用SPSS 17.0软件作LSD差异显著性分析.

2结果与分析

2.1不同激素组合对‘李广杏’幼胚萌发的影响

2.1.1不同浓度6-BA和IAA，IBA组合对幼胚萌发的影响由表1可知：6-BA和IAA，IBA不同配比处理对幼胚萌发与子叶生长具有明显的促进作用.单独添加0.2 mg/L IAA或IBA，幼胚萌发率和接种30 d后胚培苗的平均株高均较低.由此看来，单独使用一种生长素时，胚萌发和子叶生长情况不理想.在IAA浓度为0.2 mg/L时，附加0.5 mg/L 6-BA，胚萌发快(图2-A～C)，接种30 d时萌芽率达100%，且在此条件下，子叶生长健壮，叶片浓绿，茎秆粗壮，长势良好(图2-E)， 30 d时胚培苗平均株高为4.62 cm，显著高于6-BA浓度为1.0 mg/L处理(P<0.05)和CK(P<0.05).在IBA浓度为0.2 mg/L时，附加1.0 mg/L 6-BA，接种30 d时胚培苗平均株高为4.34 cm，显著高于6-BA浓度为0.5 mg/L处理(P<0.05)以及CK(P<0.05).从整体来看，A2处理下，接种30 d时胚培苗的平均株高(4.62 cm)显著的高于其他处理，但与A6(4.34 cm)处理相比没有显著性差异.由于A6条件下，幼胚萌发较慢，萌发的子叶叶尖逐渐黄化坏死，叶片卷曲发黄，叶片玻璃化明显，长势差(图2-D)，因此并不适合花后30～40 d幼胚的萌发.固幼胚萌发的适宜培养基配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L.

表1　不同浓度6-BA和IAA、IBA组合对幼胚萌发的影响

A～C：幼胚在A2处理下胚萌发动态；D：幼胚在A6处理下胚培苗30 d时的生长状态；E：幼胚在A2处理下胚培苗30 d时的生长状态；F：幼胚在B5处理下胚培苗30 d时的生长状态.

图2不同天数胚的生长情况

Fig.2The growth of the embryo after different days

2.1.2不同浓度ZT和IAA,IBA组合对幼胚萌发的影响表2所示：ZT和IAA，IBA不同配比处理下对幼胚萌发与子叶生长有较明显的影响，但效果没有6-BA和IAA，IBA显著.在IAA浓度为0.2 mg/L时，附加0.5 mg/L或1.0 mg/L ZT，胚萌发率和胚培苗平均株高与单独添加IAA相比反而降低，由此看来，IAA与ZT同时使用，并不适合幼胚的萌发.单独添加0.2 mg/L IBA，接种30 d时胚培苗平均株高为3.47 cm，与附加ZT 0.5 mg/L或1.0 mg/L的株高没有显著性关系，但附加ZT后明显提高了胚萌发率.整体来看，附加ZT对胚萌发和子叶生长并未起到明显的促进作用，如B5处理下(图2-F)，接种30 d时的胚培苗，叶片卷曲且颜色较淡，长势差.因此，附加ZT对胚萌发和子叶生长没有显著的改善作用.

综合分析，6-BA与IAA或IBA同时使用优于单独添加IAA或IBA的处理，且6-BA与IAA同时使用效果显著，而ZT与IAA或IBA同时使用时，幼胚萌发率和胚培苗平均株高不仅无提高反而有所降低.因此，适合李广杏花后30～40 d幼胚萌发的最佳培养基配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L.

表2　不同浓度ZT和IAA，IBA组合对幼胚萌发的影响

LSD法检测，小写字母表示0.05水平上的显著性.

2.2不同激素组合对胚苗继代增殖的影响

由表3可见：当IAA浓度相同，6-BA浓度为1.0 mg/L时，胚培苗增殖系数均明显大于6-BA浓度为0.5 mg/L的增殖系数.当6-BA浓度为0.5 mg/L，IAA浓度为0.05 mg/L时，胚培苗的增殖系数为3.10，显著大于IAA浓度为0 mg/L和0.1 mg/L时的增殖系数(P<0.05)；当6-BA浓度为1.0 mg/L，IAA浓度为0.05 mg/L时，增殖系数为3.42，显著大于IAA浓度为0 mg/L和0.1 mg/L时的增殖系数(P<0.05).总体来看，C5处理下的增殖系数(3.42)显著大于其他处理(P<0.05)，且增殖苗生长健壮，长势均一，叶片浓绿(图3).因此,适合胚培苗继代增殖的培养基配比为MS+6-BA 1.0 mg/L + IAA 0.05 mg/L.

表3　不同激素配比对胚苗继代增殖的影响

LSD法检测，小写字母表示0.05水平上的显著性.

3讨论

一个正常植物胚胎发生过程是一个从合子进行第1 次分裂开始至分生组织形成、幼胚建立的连续、渐进的变化过程.在这个过程中,胚由只吸收营养时期过渡到制造营养时期[8].胚龄越小需要的培养基成分越复杂[9]，且胚龄小的比胚龄大的更难成活[10]，合适的激素种类和质量浓度配比，是成功实现胚培养的重要因素[11].一般情况下，外植体类型不同，基因型不同，适宜选用的细胞分裂素、生长素的种类及浓度也有很大的差异[12-13]，如王发林等[14]的研究得出，李、杏属间远缘杂交所得杂种胚在MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培养基上继代增殖和生长良好；Yang等[15]在体外胚培养葡萄二倍体与四倍体杂种胚的研究中得出，培养基中添加GA30.35 mg/L和IAA 1.75 mg/L，不仅有助于打破胚的休眠，而且利于胚的萌发和生长；此外，王玉安[16]通过对桃胚培养的研究得出，桃胚在添加6-BA 1.0～2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L的培养基上，获得 93.8%以上的萌发率，最高可达到100%.本试验结果表明，李广杏胚培养中，诱导胚萌发的适宜6-BA浓度为0.5 mg/L，适宜IAA浓度为0.2 mg/L，在此条件下，培养30 d时胚萌发率达100%，胚培苗的平均株高为4.62 cm，且胚培苗生长健壮.由此说明，在胚培养过程中，细胞分裂素浓度并不是越高越好.胚培苗的继代增殖过程中，适宜IAA浓度为0.05 mg/L，适宜6-BA浓度为1.0 mg/L，该条件下胚培苗继代增殖系数达3.42，显著高于其他处理.在IAA浓度相同的条件下，1.0 mg/L 6-BA处理的增殖系数明显大于0.5 mg/L处理下的.但是因为只设定了IAA 0.5、1.0 mg/L 2个浓度梯度，所以不能说明6-BA浓度1.0 mg/L就是胚培苗继代培养的最佳浓度.

图3　C5处理下30 d时的增殖状态

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(责任编辑胡文忠)

收稿日期：2014-04-28；修回日期：2014-06-10

基金项目：甘肃省自然科学基金项目(3ZS061-A25-078).

通信作者：陈佰鸿，男，教授，主要研究方向为果树生理与生物技术.E-mail:bhch@gsau.edu.cn

中图分类号：S 662.2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)02-0097-05