苍耳提取物苍耳亭的结构修饰及其杀虫活性测定

孟学英，沈慧敏

(甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070)

苍耳提取物苍耳亭的结构修饰及其杀虫活性测定

孟学英，沈慧敏

(甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070)

摘要：通过对苍耳提取物苍耳亭的化学结构进行改造合成得到18种单体化合物，采用室内生测法测定了化合物对二斑叶螨和粘虫的杀虫活性.结果表明：C7和C5对二斑叶螨触杀活性最高，48 h校正死亡率分别为75.38%和69.62%；C7、C18、C5和C10对粘虫有较好的拒食活性，48 h非选择拒食率分别为74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C5、C7、C14和C4对粘虫有很好的触杀活性，48 h校正死亡率分别分别为78.74%、73.62%、65.21%和62.06%；C5、C7、C14和C10对粘虫有一定的胃毒作用，48 h校正死亡率分别为74.26%、65.32%、56.97%和53.86%.可见，C7、C5和C14不仅对二斑叶螨雌成螨有很好的触杀活性，对粘虫还有良好地触杀、胃毒和拒食作用，具有很好的开发前景；C18、C10和C4对粘虫拒食、胃毒和触杀作用也值得研究.

关键词：苍耳亭;结构修饰；二斑叶螨;粘虫；生物活性

第一作者：孟学英(1987-)，女，硕士研究生，主要从事天然产物化学修饰研究.E-mail:mengxueying0614@163.com

The chemical modifications of Xanthatin derivatives and

their biological activities onTetranychusurticae

andMythimnaseparate

MENG Xue-ying,SHEN Hui-min

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In this paper,the synthesis of 18 kinds of Xanthatin derivatives was completed by transforming the chemical structure of Xanthatin.The biological activities of these derivatives on Tetranychus urticae and Mythimna separata were also tested by indoor bioassay.The results showed that C7 and C5 had high contact toxicity on Tetranychus urticae,of which the corrected mortality rates were 75.38% and 69.62% after 48 h at a concentration of 2.0 μg/μL,respectively.In addition,C7,C18,C5,and C10 had strong non-selective antifeedant activities on Mythimna separata,of which the non-selective antifeedant rates were 74.40%,63.59%,59.98%,and 58.40% after 48h,respectively.C5,C7,C14,and C4 had high contact toxicity on Mythimna separata,of which the corrected mortality rates were 78.74%,73.62%,65.21%,and 62.06 after 48 h,respectively,while C5,C7,C14,and C10 had high stomach toxicity on Mythimna separatathe,of which the corrected mortality rates were 74.26%,65.32%,56.97%,and 53.86% after 48 h,respectively.In conclusion,C7,C5,and C14 had not only high contact toxicity on Tetranychus urticae,but also high non-selective antifeedant activity,contact toxicity,and stomach toxicity on Mythimna separatathe.All of these substances have development prospective and potential application.C18,C10,and C4 are also well worth to research,because of their non-selective antifeedant activity,contact toxicity,and stomach toxicity on Mythimna separatathe.

Key words：Xanthatin;structure modification;Tetranychus urticae;Mythimna separata;biological activity

植物次生代谢物对许多昆虫有杀灭效果，其除虫途径包括急性毒杀、抑制昆虫体内酶的活性、抑制昆虫繁殖、降低昆虫食欲、将昆虫驱离植物等[1-4].苍耳为一年生草本植物，在我国分布广泛.苍耳原先主要用于医药研究，但近年许多学者也探究了其在植物保护[5]和抑菌方面的应用.刘林等[6]以棉花枯萎病菌为供试菌，研究发现苍耳各个器官都有抑菌效果，尤其是苍耳叶的丙酮和乙醚提取液的抑菌效果较强，对几种病菌抑制率均在75%以上.本课题组先前从苍耳丙酮提取物中纯化分离得到了11 个单体化合物，利用现代核磁技术分别鉴定出化学结构，其中苍耳亭(Xanthatin,结构见图1)含量较多，约为0.1%.但苍耳亭的杀虫活性比一般杀虫剂低.为了提高苍耳亭的杀虫活性，本试验对苍耳亭的化学结构进行修饰，对苍耳亭的酮羰基进行改造，目的是通过引入其他活性基团、提高母体的脂溶性和生物活性，进而扩大应用范围.试验以二斑叶螨和粘虫为材料，测定了18种苍耳亭结构修饰物的生物活性，以期为新型植物源杀虫剂的开发奠定了理论基础.

图1　苍耳亭的结构式

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试叶螨和粘虫二斑叶螨(Tetranychusurticae)由甘肃农业大学草业学院养虫室提供；粘虫(Mythimnaseparata)由甘肃省农业科学院植物保护研究所养虫室提供.

1.1.2主要试剂和仪器丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷、石油醚(以上试剂均为分析纯，天津化学试剂有限公司)；硅胶(200-300目和300-400目)，GF254(10-40u) 薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂生产)；18种供试有机酸名称、结构式及生产厂家见表1.

表1　18种供试有机酸名称、结构式及生产厂家

智能光照培养箱中(LC-250/300，山东省临沂市万泉植保仪器有限公司)；双目解剖镜(SZW-45B,浙江舜宇光电有限公司)；薄层(TLC)；ZF-C型三用紫外分析仪；EI-MS质谱仪(VG Auto-Spec 3000 70eV)；HR-ESI-MS质谱仪(Bruker Daltonics APEXⅡ47eV)；1H NMR (300 MHz，400 MHz)；13C NMR(400 MHz) (德国Bruker公司).

1.2试验方法

1.2.1苍耳亭的化学结构修饰方法用表1所示的18种有机酸分别与乙醇发生酯化反应制备成相应的酯类物质.分别取18种有机酸10 mmoL用15 mL的甲苯溶解于三颈瓶中，加入几滴浓硫酸，搅拌混合均匀，缓慢加入乙醇10 mL.将三颈瓶装上回流冷凝管和分水器及温度计，在130 ℃的油浴中加热搅拌，反应3～4 h，期间用薄层色谱法(TLC)监测反应进程，至反应完全停止.将反应后的混合物旋转蒸发去除多余溶剂，用二氯甲烷萃取反应粗产物得到有机相，再依次用碳酸氢钠溶液(5 mL×2)、饱和食盐水洗涤有机相，用硫酸钠干燥数小时后浓缩.用柱层析法分离获得一系列下一步反应所需要的酯类底物(化合物An)，产率为90%～95%.

分别称取底物An(0.01 mmoL)于50 mL的三颈烧瓶中，用乙醇搅拌溶解.慢慢加入10 mL的水合肼，加热下搅拌回流5～7 h，期间用TLC监测反应过程，至反应停止.待反应瓶冷却后，加入适量水，抽滤得到粗产品.用乙醇重结晶后得到相应的酰胺类底物的结晶体(反应物Bn)，产率为85%～93%.

取苍耳亭25 mg(0.1 mmoL)于25 mL密封管中，加入2 mL甲醇、10 mL正己烷，用磁子搅拌溶解；向混合液中加入几滴冰醋酸、0.2 mmoL的酰胺类底物(反应物Bn).向密封管中通氮气保护，并在100 ℃的油浴中加热搅拌，反应12～36 h，期间用TLC监测反应过程，至反应停止.将反应混合物转移至旋转蒸发仪去除多余溶剂，用柱层析法分离纯化得到苍耳亭结构修饰产物(反应物Cn)，产率为78%～84%.

以上反应过程的路线如图2所示：

图2　反应过程

1.2.2苍耳亭的结构修饰物对二斑叶螨的生物活性测定将苍耳亭修饰物用丙酮分别稀释成2.0、1.5、1.0和0.5 μg/μL，用清水做对照.用25 mL的容量瓶定容，根据c=n/v，计算不同质量浓度所需要的苍耳亭的摩尔数n；根据n=m/M,计算出不同的摩尔数所需要的苍耳亭的质量m.用分析天平秤取计算得到m的毫克数，用容量瓶定容不同浓度药液，待用.

采取FAO推荐的玻片浸渍法[7].将双面胶贴在光滑玻片的一端，用零号毛笔挑取大小一致、生命力强的活泼成螨，并将螨的背部贴在双面胶带上.注意不能粘住螨的足、口器和须肢等.每个玻璃片粘30头螨.用双目解剖镜检查螨的数量.将粘有成螨的玻片浸入药液中，待5 s后取出玻片，每个浓度重复3次，用滤纸吸干玻片及螨体周围的药液，放在垫有浸水海绵的瓷盘上.瓷盘放在智能光照培养箱中，培养条件温度为26～28 ℃，湿度为70%～80%，光照∶黑暗=12 h∶12 h，24 h后镜检，用小毛笔触动螨足，不动者为死亡，求死亡率以及校正死亡率，并进行相关分析[8].

1.2.3苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的生物活性测定

1.2.3.1非选择拒食活性测定参考张宗炳[9]的方法.用叶碟法测定粘虫的非选择拒食活性，苍耳亭18种修饰物稀释浓度同前，用清水对照.将新鲜玉米叶片用圆形打孔器(直径为20 mm)打成若干叶蝶备用.将叶蝶分为等量5组，并分别在4个梯度浓度和清水中浸3 s取出晾干，置于干净的培养皿中备用.每个培养皿中放入饥饿5 h的4龄幼虫.重复10次，每处理用5叶蝶对应一头粘虫.所有处理培养皿放在光照培养箱中,培养条件同前.24 h后观察粘虫取食的情况，求非选择拒食率.

1.2.3.2触杀活性测定参考慕立义的方法[10]，并加以改进.挑选大小一致的4龄粘虫幼虫置于浸虫管中，分别放入苍耳亭18种修饰物4种处理浓度和清水中，10 s后取出，用吸水纸吸取多余的药液.然后把处理后的幼虫放入盛有足量新鲜玉米叶的培养皿中，每个处理10头试虫，重复3次.处理培养皿置于光照培养箱中，培养条件同前.24、48 h后分别观察培养皿试虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率.

1.2.3.3胃毒活性测定参考张国洲等[11]的方法.将新鲜玉米叶片用圆形打孔器(直径为20 mm)打成若干叶蝶备用.将叶蝶分为等量5组，并分别在4种处理浓度的苍耳亭修饰物和清水中浸3 s取出晾干.把每一片浸药的玉米叶蝶和未浸渍的玉米叶蝶粘合一起，至于培养皿中，放入饥饿5 h的4龄幼虫.每处理用10头粘虫，重复3次.处理培养皿放在光照培养箱中，培养条件同前.24、48 h后分别观察每个培养皿试虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率，公式如前所示.

2结果与分析

2.1苍耳亭的结构修饰

18种供试有机酸与乙醇发生酯化反应，制备成相应的有机酸乙酯底物(底物An)，底物An与水合肼发生肼解得到酰胺类底物(底物Bn)，用苍耳亭与底物Bn反应得到一系列终产物(化合物Cn)，获得对苍耳亭结构酮羰基的改造.18种苍耳亭的结构修饰物见表2.

2.2苍耳亭18种修饰物对二斑叶螨的生物活性测定

苍耳亭18种修饰物对二斑叶螨的触杀活性测定结果见表3.当修饰物质量浓度为2.0 μg/μL时，苍耳亭18种修饰物对二斑叶螨有不同程度的触杀作用，C7和C5对二斑叶螨触杀活性最高，24 h校正死亡率分别为67.50%和61.07%，48 h的校正死亡率分别为75.38%和69.62%，Duncan氏新复极差法在5%差异水平上极显著；C14、C4、C12、C6、C10、C13、C11、C9、C15、C8、C18和C17化合物对二斑叶螨有一定的生物活性，48 h的校正死亡率分别为56.28%、48.85%、47.72%、44.99%、42.88%、42.02%、39.23%、38.58%、37.12%、35.96%、33.85%和30.39%，其余修饰物(C3、C2、C16、C11) 对二斑叶螨无触杀活性，48 h校正死亡率均在30%以下.

表2　18种苍耳亭的结构修饰物结构及分子量

表3　苍耳亭18种修饰物对二斑叶螨雌成螨的触杀活性

同列数据肩标不同字母表示LSD检验的显著性差异(Duncan氏新复极差检验)(P<0.05).

2.3苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的生物活性测定

2.3.1非选择拒食活性苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的非选择拒食活性测定结果见表4.当修饰物质量浓度为2.0 μg/μL时，C7、C18、C5和C10对粘虫的拒食活性最佳，24 h非选择拒食率分别为65.48%、56.38%、52.03%和49.45%，48 h非选择拒食率分别为74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C2、C13、C9、C12、C6、C4和C14 7种结构修饰物对粘虫有一定拒食活性，48 h非选择拒食率为31.68%～56.63%，其余化合物对粘虫拒食活性很低，48 h非选择拒食率在29.43%以下.

2.3.2触杀活性苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的触杀活性测定结果见表5.当修饰物质量浓度为2.0 μg/μL时，苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的触杀活性最好的为C5、C7、C14和C4，24 h校正死亡率分别为66.29%、60.24%、53.94%和51.57%，48 h校正死亡率分别为78.74%、73.62%、65.21%和62.06%，用Duncan氏新复极差法在5%差异水平上检验极显著；C12、C6、C18、C10、C9、C2、C11、C15和C8 9种修饰物对粘虫有一定的触杀活性，48 h对粘虫的校正死亡率在52.73%～31.47%；其余5种修饰物对粘虫的触杀活性较低，24 h和48 h校正死亡率均在27.02%以下.

表4　苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的

同列数据肩标不同字母表示LSD检验的显著性差异(Duncan氏新复极差检验)(P<0.05).

2.3.3胃毒活性测定苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的胃毒活性测定结果见表6.当质量浓度为2.0 μg/μL时，C5、C7、C14和C10修饰物对粘虫的胃毒作用最高，24 h校正死亡率分别为66.93%、60.98%、50.55%和46.13%，48 h校正死亡率分别为74.26%、65.32%、56.97%和53.86%，用Duncan氏新复极差法在5%差异水平上检验极显著；C4、C18、C2和C1 4种修饰物对粘虫有一定的胃毒活性，48 h校正死亡率分别达到了49.29%、43.17%、32.17%和31.29%；其余修饰物对粘虫胃毒作用很低，48 h校正死亡率均在28.27%以下.

表5　苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的触杀活性

表6　苍耳亭18种结构修饰物对粘虫的胃毒活性测定结果

3讨论

近年来国内外学者在植物性农药的筛选与利用方面做了大量研究并取得一定的成果[12-15]，本研究也为新型高效天然杀虫剂的研制和开发奠定了重要基础.据报道，苍耳有抗菌、杀虫、抗病毒等多种活性[16-17]；高红明等[18]发现，0.053 mg/g的苍耳乙醇提取物对菜青虫的胃毒作用可以达到94%；姜双林等[19]报道了苍耳提取物对桃蚜和山楂叶螨有较强的毒杀作用；王旭等[20]、张帆等[21]、杨顺义等[22]、何静等[23]、胡冬艳等[24]相继证明了苍耳亭丙酮提取物具有抑菌活性.这些报道都是以苍耳亭各种溶剂提取混合物来研究杀虫或杀螨活性，对苍耳亭结构修饰物的杀虫或杀螨活性研究未见报道.

本试验通过测定苍耳亭18种修饰物对二斑叶螨和粘虫的触杀活性可知，C7和C5对二斑叶螨触杀活性最高，48 h校正死亡率分别为75.38%和69.62%；C7、C18、C5和C10对粘虫有较好的拒食活性，48 h非选择拒食率分别为74.40%、63.59%、59.98%和58.40%；C5、C7、C14和C4对粘虫有很好的触杀活性，48 h校正死亡率分别为78.74%、73.62%、65.21%和62.06；C5、C7、C14和C10对粘虫有一定的胃毒作用，48 h校正死亡率分别为74.26%、65.32%、56.97%和53.86%.由此看出，C7、C5和C14不仅对二斑叶螨雌成螨有很好的生物活性，对粘虫也有良好的触杀和胃毒作用，并表现出一定拒食作用，展现出良好的开发前景，后续还需进一步开展以构效关系为基础的重点研究.另外，C18 、C10和C4对粘虫的拒食、胃毒和触杀作用也值得进一步研究.

本试验对苍耳亭结构修饰研究得知，对苍耳亭结构的改造可提高苍耳亭对二斑叶螨和粘虫的生物活性.当有机酸的苯环取代基相同但取代位置不同时，化合物对螨和粘虫生物活性影响不大.如C5和C14，苯环上卤素原子氟原子，对位F取代和邻位F取代的有机酸制备得到的修饰物，其在24 h对二斑叶螨的校正死亡率分别为 61.07%和54.75%，48 h校正死亡率分别为69.62%和56.28%.两组数据差异不明显，表明有机酸中原子位置对活性的影响程度小于引入原子种类对活性的影响程度.同样C4 和C12,C6 和C7，以及C8 和C15,具有类似特性.这表明苍耳亭的化学修饰要着重考虑引入原子的种类，如引入N、P等杂原子或者卤素原子将有助于提高苍耳亭对害虫(螨)的生物活性，取代基的位置对修饰物的生物活性影响不大.应注意，当引入R基团结构过大时，也会影响其生物活性.但化合物C16质量浓度达到2.0 μg/μL，48 h后对二斑叶螨和粘虫的生物活性仍然很低，可能是化合物分子结构过大影响其在生物体内的穿透，使得其难以到达作用部位，其作用机理有待进一步研究.

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(责任编辑赵晓倩)

收稿日期：2014-04-07；修回日期：2014-05-20

基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2004-08，GNSW-2012-20).

通信作者：沈慧敏，女，博士，博士生导师，主要从事农药毒理和生物农药开发应用研究.E-mail：ndshm@gsau.edu.cn

中图分类号：TQ 450.1+1

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0102-11