响应面优化西兰花中萝卜硫素的超声辅助提取工艺

唐斌，马绍英 ，李胜，赵生琴，张品南，曹宝臣，

赵学荣1 ，康继红1，周文政2,3

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　730070； 2.兰州汇通生物科技有限公司，甘肃 兰州　730020；

3.甘肃顺意生物科技有限公司，甘肃 张掖　743000)

响应面优化西兰花中萝卜硫素的超声辅助提取工艺

唐斌1，马绍英1，李胜1，赵生琴1，张品南1，曹宝臣1，

赵学荣1，康继红1，周文政2,3

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070； 2.兰州汇通生物科技有限公司，甘肃 兰州730020；

3.甘肃顺意生物科技有限公司，甘肃 张掖743000)

摘要：对超声辅助提取西兰花中萝卜硫素的工艺进行了研究，以西兰花鲜食部分绿色幼嫩花茎和花蕾为试验材料，利用单因素及响应面法对外源芥子酶酶解西兰花后，超声波辅助乙醇提取萝卜硫素的工艺参数进行筛选及优化，在单因素试验基础上选取酶解时间，料液比和提取时间3个因素，再根据Central Composite中心复合试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，确定各因素对萝卜硫素提取率的影响程度.结果表明：超声辅提取西兰花中萝卜硫素的最佳提取条件为：酶解时间0.95 h，料液比1∶41.8，提取时间1.1 h，理论提取率为1 890.81 μg/g，验证提取率为1 814.59 μg/g，其相对误差为4.20%，表明该提取工艺参数在西兰花中提取萝卜硫素是可行的.

关键词：西兰花；超声波辅助提取；萝卜硫素；单因素；响应面

第一作者：唐斌(1989-)，男，硕士研究生，从事植物细胞工程及活性成分提取研究.E-mail：814482932@qq.com

Optimization on extraction techniques of sulforaphane from

broccoli with ultrasound-assisted by response

surface methodology

TANG Bin1,MA Shao-ying1,LI Sheng1,ZHAO Sheng-qin1,ZHANG Pin-nan1,CAO Bao-chen1,

ZHAO Xue-rong1,KANG Ji-hong1,ZHOU Wen-zheng2,3

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Lanzhou Huitong Bio-

Technology Co.Ltd.,Lanzhou 730070,China;3.Gansu Shunyi Bio-Technology Co.Ltd.，Zhangye 734000,China)

Abstract：Fresh parts of broccoli were chosen as experimental material,and extraction techniques were optimized on sulforaphane from broccoli with the ultrasound-assisted.The process parameters of extracted by ethanol with assistance of ultrasonic wave were screened and optimized though the method of single factor and response surface after exogenous myrosinase hydrolyze the fresh part.Enzymolysis time,solid-liquid ratio and extraction time were screened on the basis of single factor experiment,the effects of various factors on extraction ratio were determined by the method of response surface analysis with three factors and three levels according to the central composite design method of Central Composite.The optimum extraction conditions were as enzymolysis time 0.95 h,solid-liquid ratio 1∶41.8,extraction time 1.1 h.The theoretical extraction rate reached 1 890.81 μg/g and the verification extraction rate was 1 814.59 μg/g,and the relative error was 4.20%.The results showed that these parameters were practicable to extract sulforaphane from broccoli.

Key words：ultrasound-assisted broccoli;extraction;sulforaphane;single factor;response surface

萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的抗癌活性最强的天然活性成分之一[1-3]，其抗癌作用已在大鼠的乳腺癌防治中得到充分的证明[4-5].西兰花中含有丰富的硫代葡萄糖苷，它是十字花科植物中重要的次生代谢物，在内源芥子酶作用下可水解生成萝卜硫素[4].目前，萝卜硫素的提取研究主要是从西兰花种子中提取[6-7]，但由于种子价格高达4 000元/kg，且含量相对较低[8]，提取成本高，难以实现产业化；也有从离体细胞中提取萝卜硫素的研究[9-10]，但西兰花离体细胞含水率高，且大规模细胞培养对设备要求高，生产成本高，不利于规模化生产.从西兰花中提取萝卜硫素的研究已有报道，但提取率较低，也未能实现规模化生产.本试验拟通过添加外源芥子酶，以提高西兰花中萝卜硫素的转化率[4]，再借助超声波辅助有机提取法，提高提取效率[11-12]，并利用响应面法优化提取工艺[13-14]，以期为西兰花中萝卜硫素的规模化提取提供技术参考和理论依据.

1材料及方法

1.1材料与试剂

新鲜西兰花‘中青2号’，购于兰州市蔬菜市场；萝卜硫素标准品，购于美国Sigma公司，含量>98%；95%的乙醇(食品级)，乙酸乙酯(分析纯)，甲醇(色谱纯).

1.2仪器与设备

旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；超声波振荡仪，上海生析超声仪器有限公司；岛津高效液相色谱仪系统(配有可变波长紫外检测器和岛津Lcsolution 15c色谱工作站)，日本岛津公司.

1.3试验方法

1.3.1萝卜硫素提取工艺取80 ℃下脱水1 h、后在60 ℃下脱水至恒质量的西兰花，粉碎，过60目筛，称取10 g置于三角瓶中待用，另取新收获芥籽，粉碎，过60目筛，称取1g至三角瓶中，加50 mL蒸馏水，超声波振荡20 min，过滤除杂得酶液，向西兰花干粉中加入酶液50 mL，室温(25 ℃)下酶解1 h，冷冻干燥后加入95%乙醇400 mL超声波提取0.5 h，静置0.5 h，过滤，65 ℃旋蒸浓缩，按体积比1∶1加入乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，60 ℃旋蒸浓缩，最后用甲醇定容至25 mL，待测.

1.3.2萝卜硫素标准曲线的制备将萝卜硫素标准品配制成浓度为1.0 mg/mL的标准溶液，逐级稀释成浓度为100、75、50、25 μg/mL的标准溶液.进行HPLC色谱分析，以测定的萝卜硫素峰面积为横坐标(x)，萝卜硫素浓度(μg/mL)为纵坐标(y)进行线性回归，得到回归方程：

y=0.000 03x-0.510 4，R2=0.999 9

1.3.3萝卜硫素的HPLC分析取甲醇定容后的样液1 mL，稀释10倍，过0.22 μm有机系滤膜，进行高效液相色谱分析；色谱条件为：色谱柱：TP5-3260(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：V(甲醇)∶V(水)=65∶35；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：201 nm；进样量：20 μL.

1.3.4萝卜硫素含量计算公式萝卜硫素含量用式(1)计算：

(1)

式中：萝卜硫素含量单位为μg/g，萝卜硫素浓度单位为μg/mL，定容体积单位为mL，原料质量单位为g.

1.3.5单因素试验设计按照1.3.1所述方法提取萝卜硫素，研究不同材料碎度(20、40、60目)、酶液量(1∶0、1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4)、酶解时间(0、1、2、4、6、8、10 h)、提取次数(1、2、3)、料液比(1∶20、1∶40、1∶60)、提取时间(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、乙醇浓度(75%、85%、95%、100%)对萝卜硫素提取率的影响，每次试验重复3次，试验过程中，除考查的因素外，其他因素的试验水平为材料碎度(40目)、酶液量(1∶0.2)、酶解时间2 h、提取次数1次、料液比(1∶40)、提取时间0.5 h、乙醇浓度95%.在单因素方差分析中，通过F检验来判断单因子对萝卜硫素提取率的影响是否显著.

1.3.6响应面法试验设计在单因素试验结果的基础上，根据Central Composite中心复合试验设计原理[15]，选取3个影响最显著的因素为自变量，设计响应面试验.

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1材料碎度对萝卜硫素提取率的影响通过选择粉碎程度不同的材料，考察材料碎度对萝卜硫素提取率的影响.材料碎度影响外源芥子酶进入细胞和细胞中萝卜硫素的释放.由图1可以看出，随材料粉碎目数增大，萝卜硫素提取率明显增大，可能是因为材料粉碎程度越高，外源芥子酶越容易进入细胞内，有利于细胞内相关生化反应的发生，同时超声波辅助提取时细胞更易破碎，有利于萝卜硫素的提取.考虑到将材料粉碎至60目会增加工作量，降低工作效率，故选择40目为最佳条件.

图1　材料碎度对提取率的影响

2.1.2外源芥子酶液添加量对萝卜硫素提取率的影响通过向相同质量西兰花粉末中加入不同体积的芥子酶液，考察西兰花粉末质量与芥子酶液量的比例对萝卜硫素提取率的影响.外源芥子酶的量影响细胞中硫代葡萄糖苷的水解，通过添加外源芥子酶，促进细胞中的硫代葡萄糖苷被水解为萝卜硫苷，萝卜硫苷进一步降解成萝卜硫素，从而提高细胞中萝卜硫素含量.由图2可以看出，而相同质量的干样，随加入的酶液量的增加，萝卜硫素的转化和提取效率升高，而超过1∶2.5的酶料体积比时，提取与转化效率下降.当选择西兰花粉末∶酶液=1∶2.5时，虽提取率最高，但酶液体积相对太小，难以混合均匀，故选择1∶5为最佳条件.

图2　酶量对提取率的影响

2.1.3酶解时间对萝卜硫素提取率的影响通过设置不同的酶解时间梯度，考察酶解时间对萝卜硫素提取率的影响.酶解时间影响细胞中硫代葡萄糖苷能否完全水解成萝卜硫苷.从图3可以看出酶解0 h到1 h萝卜硫素提取率显著增加，酶解时间超过1 h后，提取率明显下降.可能是因为酶解1 h可以使细胞中的硫代葡萄糖苷充分降解，最后生成萝卜硫素，当酶解时间继续延长时，由于萝卜硫素的稳定性较差[16]，积累的萝卜硫素会发生降解或转化成其他物质，导致提取率下降，所以，选择酶解时间1 h为最佳条件.

图3　酶解时间对提取率的影响

2.1.4提取次数对萝卜硫素提取率的影响对材料进行不同次数的提取，合并提取液，考察提取次数对萝卜硫素提取率的影响.提取次数影响细胞中萝卜硫素是否提取完全.从图4可以看出，提取2次较1次提取率有所提高，但增加不显著，因而选择提取1次为最佳提取次数.

2.1.5料液比对萝卜硫素提取率的影响通过对相同质量的西兰花干粉中加入不同体积的95%的乙醇，考察料液比对萝卜硫素提取率的影响.从图5看出，料液比从1∶20增到1∶40时，提取率显著增加，由1∶40继续增大时，提取率略有下降.当提取溶剂体积增大时，增大了材料与提取剂的接触面积，提取更加充分，但增加了后续步骤的时间，导致萝卜硫素部分分解，所以选择料液比为1∶40为最佳条件.

图4　提取次数对提取率的影响

图5　料液比对提取率的影响

2.1.6提取时间对提取率的影响通过设置不同的提取时间梯度，考察提取时间对萝卜硫素提取率的影响.从图6可以看出，随着提取时间延长，萝卜硫素提取率逐渐增大，1 h时达到最大，时间继续增加，提取率有所下降.提取时间过长，能耗增加，部分萝卜硫素发生分解.所以，选择1 h为最佳条件.

图6　提取时间对提取率的影响

2.1.7乙醇浓度对提取率的影响通过选用不同浓度的乙醇作为提取剂，考察乙醇浓度对萝卜硫素提取率的影响.从图7可以看出，体积分数75%至100%的乙醇对提取率影响不显著，考虑到乙醇浓度太小，浓缩难度加大，若用99%的高纯乙醇，成本增加，故选择体积分数为95%的乙醇为最佳条件.

图7　乙醇浓度对提取率的影响

2.2响应面试验结果

2.2.1响应面试验设计结果在单因素试验的基础上，选取酶解时间，料液比，提取时间3个主要因素为自变量，设计三因素三水平RSM表，试验因素与水平如表1所示.为数据处理的方便，对表2所列的酶解时间、料液比、和提取时间的实际值进行标准化变换，变换公式如下：酶解时间A=(A*-1)/0.5，料液比B=(B*-40)/20，提取时间C=(C*-1)/0.5，其中A*、B*、C*均为实际水平，A、B、C为参与分析的逻辑水平.以3次试验所得萝卜硫素提取率的平均值为响应值(Y)，试验结果见表2.

表1　响应面设计各因素水平

采用Design-Expert 8.0对试验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程，方程可靠性由R2表示，其统计学上的显著性由F值检验，影响因素线性效应，平方效应及其交互效应的显著性由模型系数的P值检验.

2.2.2萝卜硫素提取率预测模型方程的建立及显著性检验各处理组合的试验结果见表2，用Design Expert 8.0软件对表2中的试验结果进行分析后得到二阶响应表面模型方程：

y=1 885.53-62.50A+45.35B+14.29C+40.39AB+95.14AC+75.71BC-278.81A2-250.22B2-271.53C2

表2　响应面试验设计及试验结果

表4　提取率回归分析结果

2.2.3各因素的交互作用根据图8～10中响应面及图中的等值线的形状分析酶解时间、料液比、提取时间3个因素对萝卜硫素提取率的影响.等值线的形状反映交互作用的强弱，椭圆表示2个因素之间的交互作用较强，圆形则两因素之间的交互作用较弱.由图8～10看出，AB、AC、BC之间交互作用均不显著.

3讨论与结论

有研究认为酶解条件对萝卜硫素的提取是影响最显著的因素，因此只考察酶解条件[4,18-19]的影响，本试验研究表明材料碎度，外源芥子酶液添加量，酶解时间，料液比，提取时间均对西兰花中萝卜硫素的提取率有显著性影响.说明在研究萝卜硫素的提取工艺时，应充分考虑可能的影响因素.

图8　Y=f(A,B)的响应面

图9　Y=f(A,C)的响应面

图10　Y=f(B,C)的响应面

试验中，添加外源芥子酶的量增加时，提取率显著提高，继续增加时，提取率稳定在较高水平，说明催化效果达到最佳，进一步增加酶量，提取率反而下降，可能原因是，粗酶液的用量达到一定量时，酶解理化环境发生变化，导致萝卜硫苷降解生成的萝卜硫素与萝卜硫腈比例发生变化，反应生成的萝卜硫素量减少，具体原因还有待进一步研究.

本试验通过添加外源芥子酶，促进细胞中的硫代葡萄糖苷向萝卜硫苷转化，萝卜硫苷进一步降解成萝卜硫素，从而提高细胞中萝卜硫素含量，这与王见冬等[4]、季宇彬等[19]的结论一致.但外源芥子酶的种类，酶液制备方法，酶液浓度，酶解条件等因素与超声波处理参数更进一步复合的具体量化试验研究有待开展.

在从植物中提取有效成分的研究中，多采取微波和超声波辅助以提高效率，但微波辅助提取易产生高温，不适用于稳定性较差的萝卜硫素提取.本试验采用超声波辅助提取，大大提高了提取效率，但是如何将超声波辅助与酶解提取结合起来，进一步缩短提取周期还有待研究.

本试验得到的理论提取率为1 890.81 μg/g，与谢述琼等人[20]在青花椰菜于90 ℃烘干条件下萝卜硫素的提取率480.0 μg/g有大幅提高，可能原因是所选材料，烘干条件不同，更重要的原因是提取过程中是否添加外源芥子酶以及酶活性强弱.

本研究在单因素试验的基础上，运用响应面分析法对西兰花中萝卜硫素的提取参数进行了优化，确定了西兰花中萝卜硫素的最佳提取参数为酶解时间0.95 h，料液比1∶41.8，提取时间1.1 h，按照此工艺条件可以使西兰花中萝卜硫素的提取率达到1 890.81 μg/g.

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(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-20；修回日期：2014-05-15

基金项目：教育部博士点新教师基金项目(20096202120008)；全国大学生创新创业训练计划项目(201210733009)；甘肃农业大学学生科研训练项目(20140825、20140824)；兰州市科技计划项目(2014-1-183).

通信作者：马绍英，女，实验师，研究方向为植物细胞工程，植物活性成分的提取与开发.E-mail：mashy@gsau.edu.cn

中图分类号：S 635.3

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)02-0171-07