微生物有机肥对陇东烤烟的根际营养调控及其生物效应

张书乐，刘星，邱慧珍，张文明，张春红，朱静，海龙

(甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州　730070)

微生物有机肥对陇东烤烟的根际营养调控及其生物效应

张书乐，刘星，邱慧珍，张文明，张春红，朱静，海龙

(甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州730070)

摘要：针对陇东烤烟生产中存在的因长期连作和施肥不合理引起的烟叶产量和品质下降等问题，本研究于2009年在甘肃省正宁县进行大田试验，以当地主栽烟草品种‘CV70’为试材，研究施用微生物有机肥对烤烟根际的营养调控及其生物效应，土壤理化和生物学性状的影响及其生物效应.结果表明：微生物有机肥处理(BOF)不仅显著提高了根际土壤细菌的丰富度和优势种的数量，降低了根际土壤的真菌/细菌比；而与对照(CK)相比，BOF处理也提高了根际土壤的有机质含量、有效氮和速效磷的含量.根际土壤生物学活性的改善和有效养分数量的增加促进了烤烟的生长发育，BOF处理的叶片叶绿素含量(SPAD)、叶片数和干物质量以及生育后期叶面积等指标在整个生育期内均显著高于对照(CK)，为烤烟的高产优质奠定了基础.BOF处理的上、中、下部烟叶的钾含量分别比CK增加30.20%、26.30%、50.50%，烟碱含量增加了29.85%、37.64%、16.77%；BOF处理提高了烟叶的糖含量，缩小了总糖和还原糖之间的差值，使烟叶的施木克值(糖/蛋白质)趋于适宜范围.BOF处理的产量和产值分别比CK增加了23.20%和12 545元/hm2，中上等烟的比例增加了16%，产值比CK增加了12 363元/hm2.微生物通过改善根际的生物学活性，增加了有效养分含量，为烤烟的优质高产创造了良好的根际环境.

关键词：烤烟；微生物有机肥；根际化学品质；生长发育；土壤肥力

第一作者：张书乐(1986-)，男，硕士研究生，研究方向为植物营养与逆境胁迫.E-mail:563478758@qq.com

Effects of bio-organic fertilizer on rhizosphere nutrition

regulation and its biological effects

ZHANG Shu-le，LIU Xing，QIU Hui-zhen，ZHANG Wen-ming，

ZHANG Chun-hong,ZHU Jing,HAI Long

(College of Resources and Environmental Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Abstract：The decline in yield and quality of flue-cured tobacco caused by long-time continuous mono-cropping and irrational fertilization have been the serious problems in flue-cured tobacco production in east of Gansu Province.A field experiment was carried out in Zhengning County,Gansu Province in 2009 to study the biological effects of bio-organic fertilizer on rhizosphere nutrient regulation and its biological effects.The results showed that the microbial organic fertilizer treatment (BOF) not only significantly increased the richness of the rhizosphere bacteria and the number of dominant species,reduced the rhizosphere soil fungi/bacteria ratio,but also improved the quantity of rhizosphere soil organic matter,available nitrogen and available phosphorus.The improvement of the rhizosphere soil biological activity and available nutrients amount facilitated the growth and development of the flue-cured tobacco.After applying BOF,leaf chlorophyll content (SPAD),leaf number,dry weight and leaf area index in the later growth stage were all significantly higher than those of the control (CK) in the whole reproductive period.In the BOF treatment,potassium content of upper,middle and bottom leaves increased 30.20%,26.30% and 50.50%,respectively,compared with CK,while nicotine content increased 29.85%,29.85% and 29.85%,respectively.BOF treatment increased the sugar content of tobacco leaves,narrowed the difference between total sugar and reducing sugar,making tobacco Schmuck value (sugar/protein) tend to be the optimum scope.The yield and production value of BOF treatment increased 23.20% and 12545RMB/hm2 than CK,respectively;the proportion of superior tobacco increased by 16%,and its value was 12363 RMB/hm2more than CK.By improving the biological activities of microorganism in the rhizosphere and increasing the effective nutrient content,a favorable environment for the high yield rhizosphere of flue-cured tobacco was created.

Key words：flue-cured tobacco；bio-organic fertilizer；rhizosphere chemical quality；growth and development；soil fertility

甘肃省陇东烟区属于优质烤烟(NicotianatabacumL.)种植适宜区，该区气象因子接近甚至优于全国著名烤烟生产基地云南玉溪，烤烟栽培历史悠久，烤烟生产已成为当地富民强县的支柱产业和特色产业[1].然而，由于长期连作，大量施用化肥和忽视有机肥的施用等原因造成烟叶产量和品质显著下降，尤其是内在品质下降，导致种植效益低下.因此，如何通过根际营养调控，尤其是通过施用优质有机肥，改善烤烟的根际营养环境，促进烤烟植株的生长，改善烤烟的化学品质，是该县烤烟种植中急需解决的问题.研究表明，有机肥料不仅能促进作物生长、培肥土壤、增强作物抗性，也能缓解作物的连作障碍[2].微生物有机肥是近年来推广的一种新型肥料，它集有机肥和化肥的优点为一体，并含有多种有益微生物和拮抗微生物，具有促生作物生长和抗连等多种功效.据报道，增施微生物有机肥能显著提高土壤养分的供应能力，活化土壤中氮、磷的释放，增加烤烟烟叶中的钾含量，平衡烟碱含量，减少氯含量[3].这类肥料是否适合在陇东烤烟上应用，尚未见报道.为此，本文通过在烤烟育苗时在苗床土施用且大田移栽时在烟株根际集中施用微生物有机肥，进行大田试验，研究微生物有机肥对陇东烤烟的生长发育、产量和品质，以及根际土壤生物学性状和养分供应能力的影响，以期为当地烤烟种植中有机肥的施用提供依据.

1材料与方法

1.1试验区概况

大田试验于2009年在甘肃省庆阳地区正宁县榆林子镇进行.正宁县地处黄土高原沟壑区，属大陆性季风气候，为优质烤烟种植的适宜区.全县烤烟主产区乡镇海拔一般处于1 177～1 250 m之间，全年日照2 447.4 h，日照率55%，烤烟生育期≥10 ℃积温为2 900 ℃，降水量约630 mm，蒸发量1 500 mm，无霜期180 d左右.光照充足，热量富裕.前茬为烤烟，供试土壤为黑垆土，基本理化性状为：有机质12.5 g/kg，全氮0.8 g/kg，碱解氮64.6 mg/kg，速效磷11.6 mg/kg，速效钾162.5 mg/kg，pH值(水土比5∶1)为8.3.

1.2试验设计与方法

田间试验设2个处理：CK，不施微生物有机肥；BOF，施微生物有机肥，每处理3次重复，随机区组排列，小区面积59.4 m2(9.0×6.6 m)，行距1.1 m，株距0.6 m，种植密度为15 150株/hm2.

微生物有机肥由南京农业大学提供，有机质含量49%，总养分(N+P2O5+K2O)含量8%，其中氨基酸态氮占总氮的60%以上，含抗土传枯萎病的微生物数量108个/g以上.育苗时按照苗床土1%的比例加入，移栽时在烟苗根际集中施用，用量4 g/株，60 kg/hm2.

2个处理化肥用量一致，其中氮肥用量为60 kg N/hm2，N∶P2O5∶K2O比例1∶1.5∶3，氮肥用硝铵磷(N含量32%，P2O5含量4.4%)，磷肥用过磷酸钙(P2O5含量16%)，钾肥用硫酸钾(K2O含量50%).施肥和起垄同步进行，采用双层施肥技术，下层肥料于起垄时施入，开沟20 cm深，条施80%的氮肥、磷肥和钾肥，上层肥料于移栽时施入，穴施全部微生物有机肥和剩余20%的氮肥、磷肥，20%的钾肥于现蕾期喷施.其余栽培和田间管理措施均按当地烟农习惯方法进行.

供试品种为当地主栽烟草品种‘CV70’，由正宁县烟叶生产管理局提供，烟苗采用切块育苗.

1.3样品采集与分析

起垄前采集土壤基础土样，测定土样的基本理化性状.烤烟成熟收获后，于当地烤房内进行烘烤，按小区分下部叶(从下至上第1～7位叶，去掉1～2片无效叶，共采收5片有效烟叶)、中部叶(第8～14位叶)和上部叶(第15～20位叶)各取烤后烟叶混合样.同时在烟叶收获完毕后，将烟株根系带土挖出，用抖土法采集根际土壤.烟叶化学品质指标测定采用王瑞新的方法进行[4].

1.4土壤微生物遗传多样性分析

采用Mobio Laboratories公司生产的Mobio核酸纯化试剂盒提取土壤DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测DNA的提取效果，土壤DNA总量大约在23 kb左右.

细菌PCR扩增采用16SrDNA基因特异性的V3区通用引物:F-338-GC (5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和R-518 (5′-ATTACCGCGGCTGCT GG-3′).PCR反应体系为25 μL，其中1 μL模板，2 μL 2 mmol/L dNTPs，2.5 μL10×PCR-buffer，2.5 μL 25 mmol/L Mg2+，0.3 μLTaqDNA polymerase，引物各0.5 μL，ddH2O为15.7 μL.PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min，继而94 ℃ 40 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30个循环，最后72 ℃延伸7 min，10 ℃保温.所得产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，细菌DNA的PCR产物片段长度在230 bp左右.

真菌采用18S rRNA基因特异性通用引物：GC-Fungi(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3′)和NS-1(5′-GTAGTCATATGCTT GTCTC- 3′).PCR反应体系为25 μL，其中1 μL模板，2 μL 2 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10×PCR-buffer，2.5 μL 25 mmol/L Mg2+，0.3 μLTaqDNA polymerase，引物各0.5 μL，ddH2O为15.7 μL.PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min，继而94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32个循环，最后72 ℃延伸5 min，10 ℃保温.所得产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，真菌DNA的PCR产物片段长度在370 bp左右.

细菌PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为40%～60%，在D-code DGGETM系统(Bio-Rad)中进行电泳，条件为80 V、16 h.电泳结束后进行银染，胶片用加拿大产的Win RHIZOTM扫描系统成像，所得图像分辨率为14 159×23 279.谱带分析采用Bio-Rad公司的凝胶定量软件Quantity One (4.6.2版).真菌PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为25%～35%，其余操作和分析步骤同细菌一致.

土壤微生物多样性指数H(Shannon-Weaver指数)的计算法参照文献[5].

1.5数据处理

用DPS 3.01数据处理软件对试验数据进行统计分析；图表绘制在Excel 2007软件上进行.

2结果与分析

2.1微生物有机肥对烤烟产量和产值的影响

施用微生物有机肥(BOF)显著提高了烤烟的产量和产值(表1).从表1可以看出，BOF处理的产量、产值和中上等烟比例的均显著大于CK.BOF的产量和产值分别比CK增加了23.20%和46.50%，中上等烟叶比例增加了16%，产值增加了12 545元/hm2，减去肥料成本，BOF处理的纯收入比CK增加12 363元/hm2.

2.2微生物有机肥对烟叶化学品质的影响

烟叶的总氮、钾、烟碱、蛋白质、总糖和还原糖等成分是衡量其化学品质的重要指标，烟叶烘烤后分上、中、下部叶对主要化学品质指标分析测定，结果见表2.烟叶含钾量是优质烤烟的重要指标之一.烤烟烟叶钾含量正常为2%～8%，优质烟叶的含钾量应该在2.5%以上.钾含量越高，烟叶品质越好，单位面积的产值也越高.由表2可以看出，微生物有机肥显著提高了烤烟各部位叶钾含量，上、中、下部叶分别比对照提高30.20%、26.30%、50.50%，尤其是中下部叶的钾含量在3%以上，这是BOF处理的产值明显高于CK的主要原因之一.

烟叶的总氮含量一般为1.5%～3.5%，它不仅是烤烟的重要品质指标，也涉及烟碱和蛋白质的含量.可以看出，施用微生物有机肥显著促进了烟株对氮的吸收，从而提高了烤烟各部位叶的烟碱和蛋白质含量.烟碱含量的适宜范围中上部叶为2.5%，下部叶1.8%.表2结果显示，BOF处理上、中、下部叶的烟碱含量均在最适宜范围，这是施用微生物有机肥后烤烟产值明显高于对照的又一重要原因.

总糖和还原糖含量是优质烤烟的另一重要品质指标，总糖的适宜含量为24%～28%，还原糖为18%～25%，总糖和还原糖差值以不超过3%为宜.表2结果显示，BOF处理中、下部叶的总糖含量分别比对照提高了51.60%和61.10%.BOF处理不仅显著提高了烟叶的糖含量，而且缩小了两糖之间的差值，这有利于烘烤调制过程中美拉德反应的充分进行，对烤后烟叶中性致香成分的形成有重要的意义.

施木克值(糖/蛋白质)是衡量烤烟品质的综合指标，一般以2.0～2.5为宜.微生物有机肥由于显著提高了烤烟不同叶位的糖含量，所以使各部位叶的施木克值趋于适宜范围，尤其是中下部叶处理和对照之间的差异达极显著水平.综合来看，微生物有机肥的施用能够显著提升烟叶的化学品质，使烟叶主要化学成分的含量或比值趋于协调，从而达到优质烤烟的标准.

表1　微生物有机肥对烤烟产量和产值的影响

供试肥料价格：N 6.6元/kg，P2O54.0元/kg，K2O 9.6元/kg，BIO 3.0元/kg；同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

表2　微生物有机肥对烤烟主要化学品质指标的影响

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

2.3微生物有机肥对烤烟叶片生物学性状的影响

烤烟叶片的糖(水溶性总糖和还原糖)含量是反映化学品质的一项重要指标，其形成直接来源于光合作用，除了植物的净光合生产效率之外，叶片的生物学性状(如叶片数、叶面积、叶绿素含量和干物质等)是决定糖分累积量的一项重要基础.我们在烤烟的整个生育期内，测定了2个处理的叶片叶绿素含量(SPAD值)、叶片数/株、叶面积和叶片的干物质量，结果见图1.

从图1可以看出，在烤烟整个生育期内，2个处理叶片叶绿素含量动态均表现为“先上升，后下降”的单峰曲线，BOF处理叶片的叶绿素含量始终高于CK处理，说明施用微生物有机肥能够提高烤烟叶片叶绿素的含量；从图1也可以看出，BOF处理烤烟的叶片数、叶面积和烟叶干物质量等生物学性状指标在整个生育期内均高于CK处理.

图1　微生物有机肥对烤烟叶片生物学性状的影响

2.4微生物有机肥对根际有效养分含量的影响

根际施微生物有机肥显著提高了根际土壤的有机质含量和氮磷钾有效养分的含量(表3).从表3可知，BOF处理的根际土壤中有机质含量和速效氮、磷钾的含量显著高于CK，这主要是因为微生物有机肥中不仅有近50%的有机质和一定数量的氮磷钾速效养分，而且肥料的微生物数量在108个/g以上.大量有机质和微生物向根际土壤的输入，不仅能给土著微生物提供了营养，土壤微生物数量的增加，不仅促进了土壤养分的转化和磷的活化，也促进了土壤有机质的转化和合成[6]，所以，BOF处理根际土壤的有效氮含量较CK提高了28.50%，速效磷和速效钾的含量分别提高了104.57%、7.80%.根际施用微生物有机肥通过增加和活化土壤养分，改善了根际土壤的供肥能力，为促进烤烟生长和改善品质奠定了物质基础.

2.5微生物有机肥对根际土壤微生物遗传多样性的影响

采用PCR-DGGE技术分离细菌16S r DNA和真菌18S r RNA片段的PCR产物，可以看到不同DNA片段迁移为若干条带(图2).DGGE谱带数量可以直接反映根际土壤中菌群类型的数量，DGGE谱带数量越大则说明环境中微生物丰富度越高，反之亦然.图2结果显示，BOF处理的细菌DGGE谱带为61条，CK处理为47条，说明微生物有机肥处理提高了根际土壤中细菌的丰富度；BOF和CK处理真菌的DGGE谱带数量分别为27条和28条，说明微生物有机肥对土壤真菌的群落数量变化影响不大.BOF处理下根际土壤中细菌群落数量大幅度改善了烤烟根际的微生态环境，为烤烟根系的生长创造了良好生长环境.

表3　施用微生物有机肥对根际有效养分含量的影响

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

图2　根际土壤细菌16S rDNA V3片段和真菌18S rDNA V3片段PCR产物的DGGE图谱

DGGE谱带的明暗程度可以反映土壤中微生物种群结构的生长趋势变化，条带越亮，说明这个条带代表的种数量越多，是优势种群；条带越暗，则说明这类种所占数量越少.从图2可以看出，2个处理的DGGE谱带的明暗程度不同，说明BOF处理下土壤细菌的优势种群数量高于CK.根据生态位重叠理论，微生物有机肥的施用提高了烤烟根际微生物所能够利用的资源总量和数量，种间竞争相对趋缓；而在CK处理中，资源相对有限，随着重叠的维数增加，竞争日益激烈，单个优势物种的出现其结果必然会导致更多微生物种群的生长受限以及其在生态位上的分离[7].

图3是2个处理根际土壤微生物多样性指数的比较，可以看出，BOF处理土壤细菌的多样性指数明显高于CK，真菌的多样性指数低于对照.说明在本试验条件下，同细菌相比，根际土壤的真菌在数量水平上对微生物有机肥的响应更为敏感，这也说明在根际土壤真菌群落间的协同演进机制受微生物有机肥的影响更剧烈，计算两个处理根际土壤真菌和细菌数量的比值发现，BOF处理根际土壤的真菌/细菌比值显著低于CK，降幅为42.42%.

图3　根际土壤细菌和真菌的微生物多样性指数比较

3讨论与结论

施用微生物有机肥显著提高了烤烟的产量和中上等烟叶的比例以及单位面积的纯收益，也显著提升烟叶的化学品质，使烟叶主要化学成分的含量(钾、烟碱、总糖和还原糖)或比值趋于协调，达到优质烤烟的标准.微生物有机肥提高了根际土壤有机质、有效氮、速效磷和速效钾的含量，使土壤养分的供应强度明显提高.微生物有机肥的施用显著影响根际土壤细菌和真菌的多样性，降低了土壤真菌/细菌比值，提高土壤的生物学活性，使土壤趋于健康.BOF处理下根际土壤生物学性状的优化和根际有效养分含量的提高，为烤烟根系的生长创造了良好的生长环境，进而促进了烤烟地上部，尤其是促进了叶片叶绿素含量、叶片数和干物质量等叶片生物学性状，为光合作用的进行奠定了基础，有利于叶片糖分的积累，最总提高了烤烟产量、改善化学品质的基础.

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其群落结构组成及其变化在一定程度上反映了土壤的质量，也是克服连作障碍的关键所在[8].DGGE图谱表明，微生物有机肥的施用能够影响根际土壤微生物的多样性，细菌和真菌的菌落结构和组成发生了明显的变化.这也表明在陇东烟区通过有机肥的合理施用来调节土壤的生态肥力，进而达到缓解和克服连作障碍的思路是可行的.微生物有机肥是一类包含特定功能的微生物菌种、并且生产工艺上有一个二次固体发酵的特殊有机肥，不仅能获得特定的肥料效应，而且通过足量的有机物质给功能微生物提供足够的能源物质，使这些功能微生物在土壤和烤烟根表易于定植和繁殖，充分发挥其促进作物对营养元素的吸收、刺激植物生长、拮抗某些土传病原微生物等作用[9-10].随着这些功能型微生物进入土壤，土壤微生物类群的多样性和功能的多样性首先发生变化，这也是试验中DGGE图谱DNA条带数量出现变化的主要原因.根区微生态系统中物种数量的增多，能够使得生态系统的稳定性和生态功能趋高，这也是从生态学角度来克服土壤连作障碍和抑制土传病害的必然途径.而根际土壤真菌个体数量上受微生物有机肥的影响较细菌相比更为剧烈，可能是与其生长繁殖所需的生长因子有关.

参考文献

[1]胡娟，邱慧珍，何秀成，等.施钾水平对甘肃烤烟钾含量及经济效益的影响[J].草业学报，2010，19(5)：156-160

[2]吕卫光，杨广超，沈其荣，等.有机肥对连作西瓜生长和土壤微生物区系的影响[J].上海农业学报，2006，22(4)：96-98

[3]介晓磊，王镇，化党领，等.生物有机肥对土壤氮磷钾及烟叶品质成分的影响[J].中国农学通报，2010，26(1)：109-114

[4]王瑞新.烟草化学[M].北京:中国农业出版社，2003：250-275

[5]张树生，杨兴明，茆泽圣，等.连作土灭菌对黄瓜(Cucumissativus)生长和土壤微生物区系的影响[J].生态学报，2007，27(5)：1809-1817

[6]张金柱，郭春景，张兴，等.生物有机肥对中度盐碱土理化性质影响的研究[J].湖北农业科学，2008，47(12)：1420-1422

[7]孙浩，黄璐明，黄璐琦，等.基于生态位理论的药用植物化感作用与连作障碍的探讨[J].中国中药杂志,2008，33(17)：2197-2200

[8]庄岩，吴凤芝，杨阳，等.轮套作对黄瓜土壤微生物多样性及产量的影响[J].中国农业科学，2009，42(1)：204-209

[9]樊晓刚，金轲，李兆君，等.不同施肥和耕作制度下土壤微生物多样性研究进展[J].植物营养与肥料学报，2010，16(3)：744-751

[10]杨兴明，徐阳春，黄启为，等.有机(类)肥料与农业可持续发展和生态环境保护[J].土壤学报，2008，45(5)：925-932

(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-27；修回日期：2014-05-13

基金项目：农业部公益性行业(农业)科技专项(200803031)；江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室开放课题(BM200720303)；庆阳市科技局科技专项(GK071-1).

通信作者：邱慧珍，女，博士，教授，主要从事植物营养和营养生态的教学与科研工作.E-mail:hzqiu@gsau.edu.cn

中图分类号：S 572

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)02-0119-07