高原绵羊β3-肾上腺素受体基因(ADRB3)变异与适应性进化分析

安清明，刘秀，王继卿，李少斌，胡江，罗玉柱

(甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃农业大学

动物科学技术学院，甘肃 兰州　730070)

高原绵羊β3-肾上腺素受体基因(ADRB3)变异与适应性进化分析

安清明，刘秀，王继卿，李少斌，胡江，罗玉柱

(甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃农业大学

动物科学技术学院，甘肃 兰州730070)

摘要：为了探讨ADRB3基因变异及其与高原绵羊适应性进化关系，研究以‘甘肃高山细毛羊’‘藏绵羊’及‘滩羊’3个绵羊品种为观测对象，采用PCR-SSCP方法检测ADRB3基因部分内含子序列的遗传多态性，同时基于DA遗传距离用NJ法进行系统聚类分析，明确3个绵羊品种与不同物种群体间的遗传进化关系.结果表明：3个绵羊品种共检测到5种等位基因(A，B，C，D和E)，构成了7种基因型(AA，AD，BD，BE，CC，CD和DD)，存在6个突变位点(T/C，C/T，A/G/C，T/C，A/C和T/C),‘滩羊’中未检测到等位基因A和基因型AA与AD，优势等位基因与基因型在不同群体间各不相同；聚类结果显示，不同物种总体上分为2大类，其中绵羊、山羊和家牛等聚为一支，且‘藏绵羊’与‘甘肃高山细毛羊’之间的遗传距离最小，‘滩羊’次之；而大猩猩、人和小家鼠聚为一支.研究发现，ADRB3基因在3个绵羊群体中存在丰富的多态性，且存在群体间差异.ADRB3基因多态性丰富的绵羊品种在高海拔地区适应性能力较强， ADRB3基因可能在绵羊适应性进化中具有一定功能. [3]沈永义.基因组学与动物适应性进化研究[C]//2010中国青年遗传学家论坛论文汇编.嘉兴:中国青年遗传学家论坛,2010

关键词：高原绵羊；ADRB3基因；多态性；适应性进化

The variation and adaptive evolution analysis on the

β3-adrenergic receptor gene(ADRB3)

of plateau sheep

AN Qing-ming,LIU Xiu,WANG Ji-qing,LI Shao-bin,HU Jiang,LUO Yu-zhu

(Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Gansu Engineering Lab of Genetic

Improvement in Runminants，Faculty of Animal Science and Technology，Gansu

Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Abstract：To study the variations of ADRB3 gene and its relationship with adaptive evolution of plateau sheep,the genetic polymorphhism of part of intron of ADRB3 gene in 3 plateau sheep breed(Gansu Alpine Merino,Tibetan Sheep and Tan Sheep) were detected by PCR-SSCP,NJ tree were constructed by genetic distance (DA) to define the genetic relationship between three sheep and different species groups.The results showed that 6 SNPs (T/C,C/T,A/G/C,T/C,A/C and T/C) corresponding to 5 alleles (A,B,C,D and E) and performing 7 kinds of genotypes (AA,AD,BD,BE,CC,CD and DD) were detected in the intron of ADRB3 gene in 3 plateau sheep breed.The allele D with the frequency of 0.415 9 and genotype CD with the frequency of 0.254 0 were both the highest,and allele A and genotype AA/AD were not detected in Tan sheep.Clustering results showed that different species were divided into two categories,which sheep,goat and cattle populations were clustered together,and the genetic distance between Tibetan Sheep and Gansu Alpine Merino was the smallest,and Tan sheep were smaller.Meanwhile,gorillas,human and mice populations were clustered together.The results of this study showed that the intron of ADRB3 gene has abundant polymorphism in three different populations,and there are rich genetic diversities among different sheep populations.The breeds have stronger adaptive ability in high altitude if the ADRB3 gene has rich variants.Therefore the ADRB3 gene may play a certain role in adaptive evolution in sheep,and the results provided basic data on rational utilize and effective protect plateau special resources.

Key words：plateau sheep;ADRB3 gene;polymorphism;adaptive evolution

分布在青藏高原及毗邻的川、滇、甘等高寒牧区的绵羊品种是在高寒、低氧生境下经过长期自然选择和人工选择而形成的一些高原特有品种，具有耐寒、耐粗饲、抗病力强等特征，如‘藏绵羊’‘甘肃高山细毛羊’等.近年来由于自然和人为因素的影响，高原绵羊生产性能有所下降，且疾病频发[1-2]，合理开发和保护高原绵羊种质资源迫在眉睫.高原生态因子是对绵羊种质资源开发利用的主要限制因素.随着基因组学的发展，动物适应性进化研究也提升到了全基因组水平[3].因此，应用分子遗传学方法探讨藏绵羊高原适应性(抗病、高原生态因子)进化机制，对合理利用和有效保护特有种质资源具有重要意义.

β3-肾上腺素能受体基因(β3-adrenergic receptor，ADRB3)所编码的β3-肾上腺素能受体对动物的产热机能有调控作用[4-5]，是动物生长性状的相关基因[6].绵羊ADRB3基因定位于第10号染色体，总长1.9 kb，由2个外显子和1个内含子组成[7].ADRB3基因的突变影响动物机体的产热机能.Slee[4]在绵羊育种实践中发现，群体中存在着不同耐寒性的绵羊类群.因此，对动物ADRB3基因多态性的研究可以发现突变位点对动物生产性能的影响.ADRB3基因的部分内含子区域表现出了高度多态性，且其多态性与绵羊的初生质量、生长率、屠宰质量和耐寒性相关[6,8].基于ADRB3基因与耐寒性、生长率等特征的相关性，本研究通过PCR-SSCP分子标记技术对不同绵羊品种ADRB3基因进行品种或类群间的系统进化分析，进一步了解高原绵羊的遗传多样性和资源现状，以及高原绵羊的起源、演化和分类，以期为今后高原绵羊遗传资源的保护和利用提供参考.

1材料与方法

1.1试验材料

本研究共采集绵羊血样596份，包括3个绵羊群体(‘甘肃高山细毛羊’315只，采自甘肃省天祝县；‘甘南藏绵羊’216只，采自甘肃甘南自治州；‘滩羊’65只，采自甘肃省景泰县.)每只绵羊颈静脉采血10 mL，注入到装有1 mL酸性柠檬酸葡糖糖抗凝剂(acid citrate dextrose，ACD)的采样管中，置于冰盒中短暂保存，实验室-20 ℃冻存.

1.2试验方法

采用酚-氯仿抽提法提取绵羊全基因组序列DNA[9].参照GenBank已公布绵羊ADRB3内含子序列(Genbank登录号：AF314201.1)，应用Primer 5.0在线设计特异性引物，引物序列为：R：5-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3；F：5-CCCA ACTCCAACCCGACC-3，对绵羊ADRB3基因一段长为263 bp的内含子进行扩增.引物由宝生物(大连)工程有限公司合成.

以提取的DNA为模板，扩增2个绵羊品种的ADRB3基因.PCR反应体系为：总体积20 μL，其中10×buffer 2 μL，引物各(10 pmol/μL)0.4 μL，DNA模板(50 ng/μL) 0.8 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1.5 μL,TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL ，ddH2O 14.5 μL.PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min，35个循环(94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存.PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测.

取2 μL PCR扩增产物，加入8 μL变性上样缓冲液(包括98%去离子甲酰胺、pH为8.0的10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚蓝)，经98 ℃热变性10 min，立即至于冰盒中，直至点样.将变性的产物上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=39∶1)，200 V电压、18 ℃电泳20 h，每次上样加入5种等位基因样作为标准样.结束后进行银染显色，判定基因型.

1.3ADRB3基因测序及序列分析

根据SSCP胶图分析结果，选取不同基因型的个体，纯合子进行PCR扩增，检测后直接测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子个体中PCR产物，进行克隆纯化后测序.基因由北京六合华大基因公司测定.测定结果经MegAlign软件与GenBank序列进行比对.用DISPAN软件包计算Nei’s标准遗传距离(Nei’s standard genetic distance，DS)和Nei’s遗传距离(Nei’s genetic distance，DA)[10].基于Nei’s遗传距离，采用领位相连法(Neighbor-joining)对2个群体进行系统发生树的构建，利用Bootstrap Test检验所得聚类结果的可靠性.

1.4群体遗传学分析

利用Popgen软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、纯合度(Ho)、杂合度(He)及卡方(χ2)检验，利用PIC软件计算多态性信息含量(PIC).

式中：pi和pj分别为某一特定基因位点上第i和j个等位基因的频率，n为某一特定基因位点上的等位基因数.

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

基因组DNA经PCR扩增后得到的263 bp的扩增产物，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条特异性较好的电泳条带(图1)，由图1可知，扩增产物与预期结果一致，可做后续的PCR-SSCP分析.

M：DL-500 Marker；1～4：PCR扩增产物.

2.2PCR-SSCP检测

PCR扩增产物进行SSCP分析，检测的531只绵羊样品中共检测到5种等位基因，分别为A、B、C、D和E ，7种不同基因型，分别为AA、AD、BD、CC、BE、CD和DD.(图2).

1，8：CC；2，9：BE；3，10：CD；4，11：DD；5：AA；6：AD；7：BD

图2‘甘肃高山细毛羊’ADRB3基因不同

基因型PCR-SSCP检测

Fig.2Detection forADRB3 different genotypes in

Gansu Alpine Merino with PCR-SSCP

2.32个绵羊品种的等位基因频率和基因型频率

由表1可知，3个不同绵羊群体ADRB3基因的基因型频率和等位基因频率各不相同，但均表现一定的多态，且各群体间存在差异，‘藏绵羊’与‘甘肃高山细毛羊’均存在7种基因型，5个等位基因；‘滩羊’中未检测到等位基因A，基因型AA和AD.其中基因型CD在‘甘肃高山细毛羊’与‘滩羊’群体中频率较高，分别为0.254和0.462，而基因型CC在‘藏绵羊’群体中频率最高，为0.394，可见不同群体中的优势基因型不同，‘甘肃高山细毛羊’与‘滩羊’群体中等位基因D为优势等位基因，分别为0.415 9和0.392 3，‘藏绵羊’中等位基因C为优势等位基因，为0.435 2.经χ2适应性检测，3个绵羊群体均未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)，但经χ2独立性检验表明，ADRB3基因的基因型在3个群体间的分布差异显著(P<0.01)，说明给位点基因型的分布有种间差异.

表1　3种不同绵羊群体ADRB3基因的基因型和等位基因频率

2.4ADRB3基因的碱基突变与多态性

由图3可知，3个绵羊群体ADRB3等位基因与已有绵羊ADRB3基因序列(GenBank登录号：AF314201.1)具有很高的同源性，本试验检测到在该序列中存在的6个核苷酸多态位点，约占分位点总数的2.28%，分别为86位T→C，91位C→T，200位A→G/C，216位T→C，231位A→C，233位T→C，其中转换位点为5个，颠换位点2个.

对‘藏绵羊’‘甘肃高山细毛羊’和‘滩羊’3个绵羊群体的个体进行遗传多样性分析，包括多态信息含量(PIC)、杂合度(He)、纯合度(Ho)和有效等位基因数(Ne)等度量群体遗传多样性的参数(表2).

3个绵羊品种的期望杂合度(He)均比较高，都在0.7左右，而纯合度较低，均在0.3左右，结合杂合度与纯合度，说明这3个群体遗传多样性均较丰富，存在杂种优势，对环境的有较好的适应能力，其中‘藏绵羊’最高，说明‘藏绵羊’的环境适应能力最强.PIC数值高、杂合度大，则说明群体内遗传变异大，遗传潜力大，可用于动物遗传育种研究.而PIC>0.5为高度多态，PIC<0.25为低度多态，0.5>PIC>0.25为中度多态，本研究中3个绵羊群体PIC均高于0.5，表现出高度多态性，表明这3个绵羊品种有丰富的遗传多态性，且藏绵羊最高，滩羊最低，这一结果与3个绵羊品种期望杂合度计算结果相一致.

表2　3个绵羊群体ADRB3基因遗传多态性分析

2.53个绵羊品种及类群间遗传特征

从NCBI数据库下载其他11个不同物种ADRB3基因(不同物种序列号见图4)与本试验检测得到的3个绵羊品种的核苷酸序列根据领位相连法(Neighbor-joining)构建系统进化树(图4)，由图4和表3可知‘藏绵羊’和‘甘肃高山细毛羊’之间的遗传距离较小(DA=0.011 6，DS=0.011 2)，在NJ系统发育树中聚为一支，NJ系统发育树表明本试验中的3个绵羊品种聚为一个分支且与山羊、家牛的遗传距离较近，而与大猩猩、人类遗传距离较远，这一结果与这些物种生物学上的分类一样，此外，系统发育树的Bootstrap Values较高，这2个因素均表明NJ聚类树具有较好的可靠性.

图4　不同物种ADRB3基因核苷酸序列构建的领接系统树

藏绵羊甘肃高山细毛羊滩羊藏绵羊-0.01120.0165甘肃高山细毛羊0.0116-0.0120滩羊0.02340.0130-

对角线右上方为Nei’s标准遗传距离(DS)，左下方为Nei’s遗传距离(DA).

3讨 论

通过PCR-SSCP技术检测高原绵羊ADRB3基因部分内含子序列的遗传多态性，共发现6个SNPs位点(T/C，C/T，A/G/C，T/C，A/C和T/C)，多态位点数占分析总碱基数的2.28%.其结果共检测到5种等位基因，7种不同基因型，这与Byun[8]、Yang[11]和武建亮[12]等对新西兰和中国部分绵羊品种检测结果相似，表明绵羊的ADRB3基因具有较高的遗传多样性.本研究检测到的等位基因和基因型数相比与Yang[13]对新西兰和中国部分绵羊品种ADRB3基因检测的等位基因和基因型数较少，可能是由于：与所选的绵羊种群、数量有关；与绵羊所处的生长环境有关，本试验所选的绵羊种群均为高原条件下生长的种群；不同的绵羊品种所经受的人工选择的程度不同，长期进行人工选择的种群与自然条件下繁殖的或只经过短期人工选择的种群的基因的多态性有一定的差异.3个绵羊品种丰富的多态性信息含量(PIC>0.6)和较高的期望杂合度(均为0.7左右)表明ADRB3基因多态性较为分散，即遗传基础比较广泛，因此，ADRB3基因在绵羊品种中具有很好的选育潜能.

解析基因在进化过程中受到的选择作用是研究进化生物学的一个重要方面.通常认为，基因在进化过程中会受到中性选择，净化选择和适应性进化的共同作用[14-16]，其中适应性进化是分子进化最为重要的动力，它能够加速同源蛋白的分化，同时，也是衡量分子适应性进化的重要标准.在DNA水平上检测适应性进化的方法主要有距离法、简约法和最大似然法[16-17]，距离法中可利用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，基于遗传距离聚类法中的NJ(neighbor-joining)算法构建聚类图.本试验通过该方法分析不同绵羊品种、绵羊与不同物种之间的遗传距离，从而分析ADRB3基因的适应性进化.研究发现，‘藏绵羊’与‘甘肃高山细毛羊’之间的遗传距离最小，与‘滩羊’次之，这可能是由于3种不同的绵羊所生存的环境有一定的差异，3个绵羊均在高原环境下生长，但‘藏绵羊’生长环境为平均海拔4 000 m的青藏高原地区，而‘甘肃高山细毛羊’生长在海拔2 600 m左右的地区，而‘滩羊’生活在低于1 500 m的地区[18]，且‘藏绵羊’ADRB3基因的变异性最高，‘滩羊’的最低，而‘藏绵羊’在高海拔地区的适应力最好，‘甘肃高山细毛羊’次之，‘滩羊’最差，这与3个绵羊种群在地理环境上的分布及生活环境相同，与本试验NJ聚类分析结果亦相同.本试验中，通过NJ树聚类分析，绵羊与山羊遗传关系较近，与牛次之，而与其他物较远，这与动物的遗传进化一致.因此，本研究结果可为高原绵羊适应性进化及合理利用、有效保护高原绵羊特有种质资源提供基础数据.

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(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-25；修回日期：2014-05-04

基金项目：国家国际科技合作专项(2011DFG33310)；教育部博士点基金(20116202110001)；甘肃省青年科技基金(1208RJYA043)；甘肃省科技支撑计划(1104JKCA107)；甘肃省创新研究群体计划(1210RJIA005).

通信作者：罗玉柱，男，教授，博士生导师，研究方向为现代生物技术与动物育种应用.E-mail：luoyz@gsau.edu.cn

中图分类号：第一作者：安清明，男，博士研究生，研究方向为现代生物技术与动物育种.E-mail:anqingming2009@163.com