PEG6000渗透胁迫对鸟巢蕨生理指标的影响

梁晓华，周晓俊，徐成东，2

(1.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄　675000；2.滇中高原生物资源开发与

利用研究所，云南 楚雄　675000)

PEG6000渗透胁迫对鸟巢蕨生理指标的影响

梁晓华1,2，周晓俊1，徐成东1，2

(1.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄675000；2.滇中高原生物资源开发与

利用研究所，云南 楚雄675000)

摘要：研究在聚乙二醇6000(PEG6000)室内模拟干旱条件下，比较不同浓度PEG渗透胁迫对鸟巢蕨的叶片相对含水量、可溶性糖含量、过氧化物酶活性、丙二醛含量以及游离脯氨酸量5个生理指标的影响.结果表明：鸟巢蕨叶片相对含水量与胁迫程度呈负相关；复水后各浓度处理下的叶片含水量不能够恢复.丙二醛含量、游离脯氨酸量与胁迫程度呈正相关.复水后各浓度处理下的丙二醛含量不能够恢复，游离脯氨酸含量恢复到对照水平，可溶性糖均随着胁迫的时间延长而累积，20% 浓度胁迫12 h时达到峰值105.31 mg/g，是参与鸟巢蕨渗透调节的主要物质之一，过氧化物酶活性呈先升高后降低的变化趋势，复水后降低至与对照组相近水平；说明鸟巢蕨逆境条件下，过氧化物酶上升到一个较高水平，减轻膜伤害程度，但随着膜伤害程度加深，过氧化物酶不能够在发挥作用.综合各项生理指标的分析认为，鸟巢蕨抗旱能力较差.

关键词：鸟巢蕨；PEG胁迫；室内模拟；生理指标

第一作者：梁晓华(1964-)，女，教授，主要从事植物生理和植物有效成分分析研究.E-mail:lxh@cxtc.edu.cn

Effect of PEG6000 osmotic stress on physiological indexes

ofNeottopterisnidus( L.) J .Sm.

LIANG Xiao-hua1,2,ZHOU Xiao-jun1，XU Cheng-dong1，2

(1.Department of Chemistry and Life Science,Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China；

2.Institute of Bio-resources Research and Utilization in Central Yunnan，Chuxiong 675000,China)

Abstract：Under the condition of indoor simulation drought with PEG6000,the research was conduced to compare the influence of osmotic stress of PEG6000 with different concentrations on the relative water content,soluble sugar content,peroxidase (POD) activity,malondialdehyde content and free proline content of Neottopteris nidus( L.) J .Sm leaves.The results showed that the relative water content of leaf was negatively correlated with stress level.Under the treatment of various PEG6000 concentrations,the RWC would not recover even after watering.Malondialdehyde content and free proline content were both positively correlated with stress levels.After watering,malondialdehyde content of each treatment would not restore,while free proline content returned to control levels.Soluble sugars accumulated with stress time,which reached to peak value of 105.31 mg/g after stressed under 20% concentration for 12 hours,and it was the main material involved in the osmotic adjustment of Neottopteris nidus (L.) J .Sm.Activity of peroxidase increased first and then decreased,lowered closely to the control group after watering.It was indicated that in adversity conditions,peroxidase (POD) of Neottopteris nidus(L.) J.Sm increased to a higher level to relieve membrane damage,however,peroxidase (POD) could not continue to play a role when the membrane damage getting worse.Based on the analysis of the physiological indexes,we concluded that the drought-resistant ability of Neottopteris nidus(L.) J .Sm was week.The study could provide theoretical basis for the moisture management of Neottopteris nidus(L.) J .Sm.

Key words：Neottopteris nidus(L.) J .Sm；PEG stress；indoor simulation；physiological indicators

自20世纪90年代开始，中国蕨类植物的研究逐渐由植物分类发展演变为对观赏蕨类的开发利用.观赏植物的发展经历了一个由观花到观叶的过程.目前，观花植物栽培技术已经较为成熟，品种也很丰富，但一些观叶的蕨类植物则刚刚被认识、接受，市场前景广阔.我国虽然拥有较为丰富的观赏蕨类资源，但园林应用的种类及其应用方式都还十分缺乏，国内现在的蕨类市场开发处于初创阶段.因此，对观赏蕨类植物研究具有一定的经济效益和生态意义.鸟巢蕨[Neottopterisnidus(L.) J.Sm.],又名巢蕨、山苏花、王冠花，为铁角蕨科鸟巢蕨属多年生阴生草本植物[1].鸟巢蕨可作为观赏植物栽培，尤其是近年来用作切叶发展迅速，栽培面积不断扩大.鸟巢蕨原产于热带亚热带地区，在我国广东、广西、海南和云南等地均有分布，在亚热带其他地区也有分布.其常成大丛附生于雨林或季雨林内树干上或林下岩石上或灌丛基部，适生海拔100～1 900 m[1].

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是模拟干旱胁迫最好的材料[3].由于PEG的性质特殊，在很多行业中都有广泛的用途[4].Rawlor[5]用随机标记的14C对PEG进行了测定，认为 PEG1000、4000～20000能模拟干旱逆境的原因是其可阻塞植物的输导组织.Kaufmann和Eckard[6]对PEG反复研究后得出的结论是，PEG6000诱导水份逆境所得的效果与将土壤逐步干旱是一样的，唯PEG400有毒负作用.聚乙二醇6000(PEG6000)模拟干旱胁迫环境的研究越来越广泛，因本身不易自由通过植物组织细胞壁，不易渗入活细胞内，不会给种子内增加营养物质，无毒，但能使活细胞缓慢吸水等优点，而常被作为干旱胁迫的渗透胁迫剂[4].

我国许多地区干燥少雨，易受到干旱胁迫的影响，干旱胁迫是植物逆境最普遍的形式，它是影响植物正常生长发育的主要非生物因素之一[7]，能够引起植物水分亏缺，进而影响植物的形态、光合和生理生化指标的变化[8].掌握其栽培过程中的水分生理尤为重要.因此，对植物的抗旱性及干旱胁迫下的生理表现进行相关研究，有利于了解植物的干旱适应机制，探求植物抗旱的适应调控措施，对充分发挥森林的生态效益具有重要的作用，并为今后绿化应用提供科学依据.

PEG渗透胁迫对植物生理指标的影响的研究很多，但对蕨类植物的研究较少，而对鸟巢蕨的研究尚未发现研究报道.因此，本研究拟通过PEG6000室内模拟干旱-复水的方法[9-10]，对鸟巢蕨进行干旱处理，研究干旱胁迫对其叶片相对含水量、可溶性糖含量、过氧化物酶活性、丙二醛含量、游离脯氨酸量等相关生理指标的影响，探究鸟巢蕨适应生长的水分环境，寻求水分环境对鸟巢蕨生理指标的影响规律，以对鸟巢蕨的引种栽培、开发利用和科学研究提供科学依据与参数.

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料鸟巢蕨于2013年3月1日购买于云南省楚雄市龙江公园，选择长势一致的12株苗盆栽，盆规格统一为16 cm×16 cm，基质配比为腐殖土∶蛭石∶沙=5∶1∶1[9]，置于烘箱内60～80 ℃烘烤2 h.均匀分配于每个花盆，装置花盆14 cm处.室内养护，进行正常的水分管理.

1.2试验方法

1.2.1试验设计2013年4月将盆栽苗木按照叶面积均匀分成4组，每组3株.4月18日将根系用清水小心洗净泥土，移入水中进行无土栽培.待生长稳定后，再将其移入不同浓度的PEG6000溶液中对苗木进行模拟干旱胁迫处理.利用不同浓度的PEG6000溶液进行模拟干旱胁迫处理.设3个PEG浓度为处理梯度：10%、20%、30%，以蒸馏水为对照[9].处理开始后,分别于0、4、8、12、16、20、24、28 h取非当年生的成熟叶片进行生理指标测定，3次重复.胁迫28 h后复水，并于复水72 h后来采样测定复水情况[9].

1.2.2生理指标的测定叶片相对含水量(RWC)采用烘干法[10]：迅速剪取植物材料，电子天平称取鲜质量(FW).放入烘箱内，105 ℃杀青10 min，然后把烘箱的温度降到80 ℃左右，烘至恒质量.放入干燥器中冷却至室温，称其干质量(DW).称过干质量后浸入水中，数小时后取出，用吸水纸吸干表面水分，立即称质量；重复浸泡一段时间后，再次取出，吸干表面水分，称鲜质量，直到2次称质量的结果基本相等，最后的结果即为饱和鲜质量(SFW).按公式计算相对含水量：

RWC% =(FW-DW)/(SFW-DW)×100%

可溶性糖含量采用蒽酮比色法[9]：取鲜叶0.5 g，用蒸馏水研磨后于沸水中浸提3次，用0.5 mL蒽酮乙酸乙酯剂和5 mL浓硫酸显色，用722S型可见分光光度计在630 nm处比色测定.

过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法[10]：提取粗酶液，测定酶活性，取光径1 cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3 mL，KH2PO41 mL，作为较零对照，另1只中加入反应混合液3 mL，上述酶液1 mL，立即开启秒表计时，于分光光度计470 nm波长下测量D值，每隔1 min读数1次.以每分钟D变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.鲜质量g]表示.

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[11]：剪取各不同处理的植株叶片中部0.5 g，放人研钵中，加入5%三氯乙酸(TCA)2.0 mL，少量石英砂研磨，研磨液倒人离心管中.另取3.0 mL的TCA用来清洗研钵，清洗液也倒入离心管中，在3 000 r/min的离心机中离心10 min.分别取上清液2 mL各3份，各放人10 mL管中，每管中加入2 mL 0．67硫代巴比妥酸(TBA)，混合后在100 ℃水浴中煮沸30 min.反应溶液冷却后在离心机中以3 000 r/min离心10 min，最后分别在450，532和600 nm处测定上清液的吸光度.按公式：C=6.45×(A532-A600)-0.56A450，计算MDA含量.

游离脯氨酸量采用磺基水杨酸法[11]：取鲜叶0.5 g，用3%磺基水杨酸浸提，2.5 mL酸性茚三酮显色，5 mL甲苯萃取，用722S型可见分光光度计在520 nm处比色测定.

1.3数据处理

采用Mcrosoft Excel 2003和SPSS 20.0对数据进行统计分析.

2结果与分析

2.1PEG渗透胁迫对鸟巢蕨叶片相对含水量的影响

由图1可知，不同PEG浓度处理下，鸟巢蕨叶片含水量均随着处理时间的延长而降低，下降幅度随胁迫浓度的提高而变大.叶片相对含水量与胁迫程度呈负相关(r*=0.706).在处理4 h时，10% PEG处理叶片含水量为84.15%，与对照差异不显著(P=0.06)，而20%和30%胁迫下的叶片含水量分别为80.54%(P=0.04)和76.62%(P=0.02)，与对照差异显著.胁迫28 h时30%、20%和10%浓度处理的相对含水量分别为对照的39.20%、46.87%和50.37%.复水后各浓度处理下的叶片含水量未恢复.

图1　PEG 渗透胁迫对鸟巢蕨叶片相对含水量的影响

2.2PEG渗透胁迫对鸟巢蕨叶片可溶性糖含量的影响

由图2可知，在PEG胁迫下，鸟巢蕨可溶性糖的含量总体呈现先升后降的趋势，但每个处理水平下达到峰值的时间不同.10%PEG 胁迫下24 h时达到最大值，为对照的268.68%.20%PEG 胁迫下，糖含量在上升过程中出现2次波峰，分别在12 h，为对照的295.98%，24 h，为对照的226.09%.30%PEG 胁迫下，在8 h时达到最大值，为对照的290.26%.复水后10%和20%胁迫的糖含量仍然高于对照，分别为对照的196.6%和157.71%.30%梯度的降为对照的88.12%.

图2　PEG渗透胁迫对鸟巢蕨可溶性糖含量的影响

2.3PEG渗透胁迫对鸟巢蕨过氧化物酶活性的影响

由图3可知，随着PEG 浓度的升高和胁迫时间的延长,过氧化物酶活性呈先升高后降低的变化趋势.复水后，过氧化物酶活性降低至与对照组相近水平.10%PEG 胁迫下24 h达到最大值，为对照的450%.20%PEG 胁迫下20 h达到最大值，为对照的833.3%.30%PEG 胁迫下12 h达到最大值，为对照的533.3%.复水后，10%PEG 胁迫的过氧化物酶含量仍然高于对照，为对照的133.3%.20%PEG 胁迫的过氧化物酶含量与对照相同.30%PEG 胁迫的过氧化物酶含量低于对照，为对照的66.7%.

2.4PEG渗透胁迫对鸟巢蕨丙二醛含量的影响

由图4可知，不同PEG浓度处理下，鸟巢蕨丙二醛含量均随着处理时间的延长而上升，上升幅度随胁迫浓度的提高而变大.丙二醛含量与胁迫程度呈正相关(r*=0.740).复水后各浓度处理下的丙二醛含量未恢复.PEG胁迫24 h时，10%PEG胁迫的丙二醛含量为对照的418.7%，20%PEG胁迫的丙二醛含量为对照的589.7%，30%PEG胁迫的丙二醛含量为对照的654.2%.复水后，10%PEG胁迫的丙二醛含量有下降的趋势，仍高于对照，为对照的382.1%.20%、30%PEG胁迫下丙二醛含量保持上升趋势.

图3　PEG渗透胁迫对鸟巢蕨叶片过氧化物酶活性的影响

图4　PEG渗透胁迫对鸟巢蕨丙二醛含量的影响

2.5PEG渗透胁迫对鸟巢蕨游离脯氨酸含量的影响

由图5可知，不同PEG浓度处理下，鸟巢蕨叶内游离脯氨酸含量均随着处理时间的延长而上升，上升幅度随胁迫浓度的提高而变大.游离脯氨酸含量与胁迫程度呈正相关(r**=0.993).复水后各浓度处理下的游离脯氨酸含量恢复到对照水平.在处理4 h时，10%、20%和30%浓度PEG胁迫的游离脯氨酸含量分别为对照的116.3%、120.2%、139.9%.胁迫28 h时10%、20%和30%浓度PEG胁迫的游离脯氨酸含量分别为对照的313.3%、342.9%和370.6%.复水后各浓度胁迫的游离脯氨酸含量恢复到与对照相近水平.

图5　PEG渗透胁迫对鸟巢蕨游离脯氨酸含量的影响

3讨论与结论

叶片相对含水量的大小可以反映植物的渗透调节能力，是水分缺失条件下植物是否维持正常生长的重要指标[10].试验结果表明，随着PEG浓度的增加和胁迫时间的延长，鸟巢蕨的叶片相对含水量与胁迫程度呈负相关，复水后各浓度处理下的叶片含水量不能够恢复，说明鸟巢蕨叶片保水能力差.

可溶性糖是植物叶片细胞内的一种渗透调节物质，可溶性糖的主动积累，可以参与降低植物体内渗透势，以利植物在于旱逆境下维持植物体正常生长所需水分，以提高抗逆性[11].试验结果表明，鸟巢蕨叶片中可溶性糖对渗透胁迫反应敏感，胁迫程度越高，可溶性糖积累越迅速.但胁迫时间过长会使其进入耗尽期，且胁迫浓度越高，进入耗尽期的时间越早，此时再复水不能改变下降趋势.说明围栏网试验渗透胁迫，鸟巢蕨叶内的可溶性糖含量的明显积累，提高了抗逆性，而其含量的很快下降说明了鸟巢蕨的抗逆性差.

过氧化物酶能有效清除活性氧，保证细胞正常的生理功能，维持其对干旱胁迫的抗性.有研究表明，耐旱植物在逆境条件下能使保护酶活力维持在一个较高水平，有利于清除自由基，降低膜脂过氧化水平，从而减轻膜伤害程度[15].试验结果表明，随着PEG浓度的升高和胁迫时间的延长,鸟巢蕨过氧化物酶活性呈先升高后降低的变化趋势.原因可能是随着胁迫程度的上升，膜伤害程度加深，过氧化物酶不能够在发挥作用.复水后，过氧化物酶活性降低至与对照组相近水平，说明了鸟巢蕨不是耐旱植物.

丙二醛是植物细胞膜脂过氧化物之一，能与细胞内各种成分发生反应，从而引起各种酶和膜的损伤.MDA大量增加时，表明体内细胞受到较严重的破坏，因此，丙二醛的含量是衡量膜透性的一个重要指标[11].试验结果表明，丙二醛含量与胁迫程度呈正相关；复水后各浓度处理下的丙二醛含量不能够恢复；鸟巢蕨在受到干旱等胁迫时，丙二醛含量的高低与细胞膜的伤害程度呈正相关，与其抗旱能力呈负相关，说明鸟巢蕨抗旱能力较差.

植物遭受逆境后会积累脯氨酸，作为胞质渗透调节剂，脯氨酸积累的多少与植物抗逆性有关，可作为抗逆性筛选的重要指标[10].试验结果表明，游离脯氨酸量与胁迫程度呈正相关.这和徐新雨[18]研究报道一致，即不耐旱的植物在胁迫中表现出高的脯氨酸含量.复水后各浓度处理下的游离脯氨酸含量恢复到对照水平.

综合比较5个指标以及复水后的恢复情况，认为鸟巢蕨对10～30%浓度的PEG胁迫都不具有适应能力，是抗旱性极差的植物，在栽培管理过程中要注意保持其充足的水分，进行严格的水分管理.

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(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-06-27；修回日期：2014-12-31

基金项目：国家自然科学基金项目“云南产铁角蕨植物对水分和光照的生理响应”(31260095).

通信作者：徐成东，男，教授，博士，主要从事植物分类与植物生态学研究.E-mail:chtown@cxtc.edu.cn

中图分类号：Q 945.17

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0092-05