口蹄疫病毒部分免疫功能肽段的合成、鉴定及免疫功能评价

龚真莉，蒋韬，祁淑芸，陈国栋，李勇，刘艳红

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点

开放实验室，甘肃 兰州　730046；2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州　730046；

3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070)

口蹄疫病毒部分免疫功能肽段的合成、鉴定及免疫功能评价

龚真莉1，蒋韬1，祁淑芸1，陈国栋2,3，李勇1，刘艳红1

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点

开放实验室，甘肃 兰州730046；2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州730046；

3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070)

摘要：利用微波多肽合成仪Liberty，合成O型口蹄疫病毒VP1 140～160和200～213氨基酸序列的两条肽段，并用高压液相色谱仪及质谱分析仪就合成的多肽片段进行分析纯化和鉴定;将合成的多肽片段作为半抗原与载体蛋白BSA偶联，免疫小鼠，进行血清制备和抗体效价测定.结果表明：成功合成了口蹄疫2条免疫功能短肽，其纯度均达到80%以上.半抗原成功与载体蛋白偶联；小鼠抗血清经过抗体效价检测证明半抗原与载体蛋白偶联组的抗体水平高于其余2个对照组,但是达不到免疫保护的水平.同时说明Liberty是一种操作简单、方便，合成效率高的多肽合成仪，可高效合成研究用多肽.

关键词：口蹄疫病毒；微波多肽合成;免疫功能肽段

第一作者：龚真莉(1981-)，女，硕士研究生，助理研究员，研究方向为病毒分子生物学.E-mail：gongzhenli@caas.cn

Characterization and evaluation of immune function

on synthesized FMDV peptides

GONG Zhen-li1,JIANG Tao1,QI Shu-yun1,CHEN Guo-dong2,3,LI Yong1,LIU Yan-hong1

(1.Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture,State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,

Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046，China;

2.China Agricultural Vet.Bio.Sci.and Tech.Co.,Ltd,Lanzhou 730046，China;3.College of Veterinary

Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China)

Abstract：Type O FMDV VP1 140～160 and 200～213 amino acid fragments were synthesized by LibertyTM automatic microwave peptide synthesizer.Two polypeptides were purified and identified by HPLC and MS.Mice were immunized by polypeptide conjugated to BSA and antibody titers were measured.The results showed that the two peptides were successfully synthesized and their purity was more than 80%.As the haptens,they were effectively conjugated with the carrier protein.Their anti-mouse serum antibody titers were higher than that of the other two negative control groups;however the antibody levels of immune animals were not up to the scope of protection.It also proved that LibertyTM was a simple,convenient and efficient peptide synthesizer which could synthesis research-grade peptides efficiently.This study supported evidence and a new method of antigen peptide synthesis to prepare for vaccine research.

Key words：FMDV；immune function of peptides；microwave pepticle synthesis

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、猪、羊等多种偶蹄动物的一种高度接触性传染病.由于本病传播迅速、发病率高，往往造成大流行，而且严重影响国内、国际贸易，造成巨大的经济损失[1-2],世界各国都高度重视对该病的预防和控制.目前除了发达国家外，大多数发展中国家都通过注射疫苗的办法来控制该病的流行.传统的灭活疫苗仍然是国内外口蹄疫防治的主导方法，但是灭活疫苗容易引起过敏等副反应及可能引起生物安全的问题，因此国内外研究者近年来对新型疫苗进行了大量的研究[3].

20世纪70年代开始，先后有基因工程亚单位疫苗、病毒载体疫苗、合成肽疫苗等.合成肽也是解析口蹄疫病毒的结果和功能的非常有用的手段.经过长期试验结果表明，口蹄疫病毒最重要的抗原决定簇位于VP1上，而VP1的140～160和200～213氨基酸序列段都诱导病毒产生抗体[4].Pfaff等研究结果表明，对应与这2个残基区段的合成肽，与“载体”蛋白连接可提高其免疫原性，用来免疫试验动物，合成肽疫苗能激发高水平的中和抗体，而且免疫动物可耐受强毒攻击.但140～160肽明显占优势，代表最重要的抗原位点.目前合成肽疫苗的研究主要集中在该位点所产生的免疫保护[5].

多肽固相合成涉及多步反应,但中心思想就是把每一个保护好的氨基酸作为建筑块来构建(合成)一个生物大分子—多肽.多肽合成可以简单归结为“缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合”[6].

利用本单位多肽合成仪Liberty，本研究拟合成2条多肽，分别为口蹄疫O型VP1区段的140～160区段和C末端200～213残基区段.多肽合成后鉴定及纯化肽段，为下一步试验动物免疫及抗体水平评价准备材料.经过纯化的多肽片段作为半抗原与载体蛋白偶联，将偶联复合物作为抗原免疫试验动物小鼠，经过3次免疫制备抗血清，利用口蹄疫抗体检测试剂盒评价抗体水平.

1材料与方法

1.1试验方法

1.1.1参考序列口蹄疫O型参照比较序列：O-TW-205-98;O-TW-257-2009;O-TW-258-2009，其序列均引自GenBank.

1.1.2氨基酸序列VPGH1：5′-STNNVRGD LQVLAQKAERTLP-3′；VPGH2：5′-RHKQRIV APAKQLL-3′

1.1.3主要试剂及试剂盒合成所需15种氨基酸、2种树脂及其它溶剂试剂均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度大于99%的分析纯.偶联试剂EDC及载体蛋白均为国产分析纯.O型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒(LPB-ELISA)购于兰州兽医研究所.

1.1.4试验动物所用试验动物为兰州兽医研究所动物场提供的清洁级、6～8周龄、雌性BALB/C小鼠.

1.1.5试验仪器合成肽所用仪器为研究级微波多肽合成仪，美国CEM公司，型号为Liberty.手动切割所需摇床为江苏海门其林贝尔仪器有限公司生产的水平摇床，型号为TS 200.高效液相色谱仪为北京莱伯泰科仪器有限公司的Labtech LC600，质谱仪为Bruker Daltonics公司的autoflex TOF/TOF型号，旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂生产的RE3000旋转蒸发器.

1.2试验方法

1.2.1合成方法建立按照顺序依次打开电脑、仪器、软件，根据所要合成的多肽创建相应的序列及合适的方法.2条多肽均选择合成量为0.05 mmol/L.

1.2.2多肽合成利用软件的自动计算功能，将合成所需各种试剂按要求配好，并安装到仪器相应的位置，检查无误后，点击Start键，仪器合成开始进行.多肽合成仪即按照“缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合”这一过程按照序列将相应的氨基酸偶联，直至最后一个氨基酸，反应自动结束.

1.2.3多肽的手工切割、沉淀及旋蒸仪器合成多肽后产品以与树脂结合的形式被自动转移至原树脂瓶，然后进行手工切割.室温下将装有切割剂和结合了氨基酸的树脂的容器放于水平摇床下摇动切割1.5 h.将切割完成的多肽溶液用冰乙醚高速离心进行多肽沉淀，离心后管底白色固体.将沉于管底的多肽用旋转蒸发仪进行旋蒸，多肽经旋蒸干燥后即得到了多肽粗产品，置于-20 ℃度冰箱保存.

1.2.4粗肽的纯化及鉴定将合成好的粗肽溶解于H2O∶CH3CN=1∶1的溶液中进行HPLC检测其纯度.HPLC检测条件为：柱子C18；液体梯度：5%～60% B加A经30 min(A：0.05% TFA加H2O；B：0.025% TFA加CH3CN)；使用检测波长：214 nm.经过HPLC鉴定其纯度以后，对有必要再经过纯化的多肽进行纯化回收.将经过纯化回收的样品送公司进行质谱分析鉴定.

1.2.5半抗原与载体蛋白的偶联利用碳二亚胺法(CDI)分别偶联VPGH1，VPGH2两条多肽和载体蛋白BSA.将2条多肽溶于0.01 mol/L,pH 7.4的PBS溶液中，浓度为9 mg/mL.400 μL VPGH1溶液中加入60 μL EDC，500 μL VPGH2溶液中加入70 μL EDC室温磁力搅拌2 h,结束后在混合液中分别加入5 mg BSA,室温搅拌5 h.4 ℃蒸馏水透析过夜，换透析液再透析4 h,-20 ℃保存备用.

1.2.6试验动物免疫及抗血清的制备取6～8周龄雌性BALB/C 小鼠20只,随机分为4组,每组5只.分别用偶联的2种多肽载体抗原和两组对照(BSA对照组，生理盐水对照组)进行3次免疫:首次按每只小鼠50 μg的剂量将多肽与等体积弗氏完全佐剂混匀后,肌肉多点注射.间隔2周后进行第2次免疫,使用弗氏不完全佐剂,偶联多肽剂量为每只小鼠30μg.二免2周后用纯抗原进行脾内加强免疫,剂量为每只小鼠30 μg.三免3～4 d后采血、制备血清、检测抗体效价.

1.2.7液相阻断ELISA测抗血清免疫效价测定用O型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒，分别检测几组小鼠的血清，评估多肽人工抗原的免疫效果.

2结果与分析

2.1HPLC鉴定结果

经高效液相色谱鉴定，表明合成的2个肽段均得到了主要产物.图1为VPGH1肽段的检测图谱，图2为VPGH2的检测图谱.从这2个图的主峰面积可以算出，VPGH2肽段的纯度高于VPGH1，这也证明了肽段的长度越长，主产物的产率越低.VPGH1多肽的纯度低于80%，故将29.430分的多肽峰进行纯化回收并进行质谱鉴定.VPGH2肽段的纯度高于90%，将15.202分出现的多肽峰进行回收.

图1　合成肽VPGH1的HPLC分析

图2　合成肽VPGH2的HPLC分析

2.2质谱鉴定结果

经Bruker Daltonics公司的autoflex TOF/TOF质谱仪鉴定VPGH1肽段(图3)，证明经过纯化的VPGH1肽段为目的肽段.

2.3半抗原与载体蛋白的偶联结果

经过SDS-PAGE电泳结果显示2种半抗原均成功与载体蛋白BSA偶联(图4).

2.4小鼠抗血清抗体效价测定结果

4组试验动物，20只小鼠经过3次免疫，部分小鼠在此期间由于自然死亡、相互撕咬等原因被淘汰.其中VPGH1组剩余4只小鼠，VPGH2组剩余3只，BSA对照组剩余5只，生理盐水组剩余4只.通过O型口蹄疫液相阻断ELISA 试剂盒检测表明VPGH1组有2份血清检测到抗体，VPGH2组中有一份血清产生了口蹄疫抗体，但效价均较低.对照组血清均未检测到抗体.ELISA检测结果如表1所示.

图3　合成肽VPGH1片段的质谱鉴定

1：BSA电泳条带；2：VPGH2偶联BSA电泳条带；3：VPGH1偶联BSA电泳条带；M：蛋白质分子量标准.

图4SDS-PAGE图

Fig.4SDS-PAGE

表1　ELISA检测结果

3讨论与结论

合成肽疫苗是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗,是最为理想的安全新型疫苗,也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一[3,7-8].合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)合成肽疫苗，主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位(VPI环)或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究[3,8].近年来，随着合成肽疫苗研究的深入，越来越多口蹄疫合成肽相关产品已经面世.口蹄疫合成肽疫苗近年来在我国已经占有一定市场份额，合成肽疫苗与传统灭活疫苗相比具有以下优点：能有效避免不良反应的发生，深受养殖户的喜爱；质量可控，成本低，更适宜规模化生产；在肽序列中有限位置上设置不同氨基酸，利用各种肽段的组合就能有效克服抗原的变异性.也可使用一些保守序列或多种不同保护性序列合成疫苗肽，从而使合成肽疫苗具有广谱性；除传统免疫途径外，还可以通过鼻内、口腔、皮肤等多种方式接种.综上，合成肽技术不仅在口蹄疫疫苗研究中取得进展而且已经投入市场，获得了不错的经济价值.多肽与蛋白质药物已经是当今国际市场上的一大类药物，正逐步成为本世纪药物发展的主流方向，我国也已将多肽药物的研究开发列入未来的重点发展方向[7-8,10].因此，随着多肽合成技术的发展，多肽合成已经成为生物、医学、化学等领域研究重点.

在本研究中，通过多肽合成前期准备到合成方法的建立再到仪器合成，最后到多肽片段的手动切割及沉淀，总结的注意事项以如下：自身保护：由于多肽合成过程中时用的试剂和溶剂绝大部分可对环境和人体造成伤害，故，合成实验室必须配备良好的通风设备和防护面罩及手套.特别在多肽切割环节，TFA为强酸有强挥发性，对粘膜有破坏，试验时务必戴好防护口罩；在建立合成方法之前，仔细研究序列特征，对难以合成的部分氨基酸采用双偶联或提高耦合温度等办法，提高合成效率；氨基酸序列越长，难合成氨基酸数量越多，合成效率越低；为了节约试剂，可先进行小量合成，根据合成效率优化实验条件后再增加合成量；合成过程中产生的废液应集中、专人处理，不可随意倾倒至下水系统；合成好的粗肽旋蒸成为粉末后，可在-20 ℃冰箱长期保存，用之前溶解使用.

近年来，有研究报道，用具有性质稳定、不干扰偶联分子、廉价易得等特点的蛋白作为载体，偶联半抗原制备人工抗原，能够表现出能增加半抗原的免疫原性，从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加，被广泛应用[9,11-12].常用来作为合成工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等.牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外，这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解时，其活性基团仍呈可溶状态，因此，这2种蛋白质是最常用的载体蛋白质[13-14].本试验选用碳二亚胺法偶联多肽半抗原与BSA，该连接方法操作简单、作用时间短、偶联效果好，结果表明两段半抗原均成功与载体蛋白偶联.

试验通过免疫试验动物及抗体水平评价，结果表明：含2段多肽片段的人工抗原均有一定水平的抗体产生，但效价很低.这与半抗原的长度较短、空间结构单一，没有形成有效的空间构象等因素有关.口蹄疫病毒具有免疫原性的抗原位点都是构象位点,而短的合成肽段很难在体内形成有效的构象.其中的原因有很多，如：肽段短而易被迅速地排出体外，也可能缺少强的和适宜的辅助T细胞表位.目前研究者采用许多方法改善短肽抗原的免疫原性，最简单的办法就是增加肽段的长度和以化学方法使合成肽与某种大的载体蛋白结合，取得了不错的效果.目前市面上的多肽疫苗均同时包括这两条短肽，并进行了一些结构的修饰，使其空间构象与病毒颗粒上的天然位点相似，所以具有不错的免疫效果.而此试验作为多肽合成及疫苗研制等基础性研究，证明了这2条肽段有一定的免疫原性，为后期的改造和再研究提供了数据支持，已经达到实验的预期结果.

本试验利用微波多肽合成仪Liberty，通过筛选最具代表性和被国内外认可的口蹄疫免疫功能区的氨基酸片段，多次优化试验条件成功合成2条多肽.利用碳二亚胺法成功将2条合成的多肽与载体蛋白BSA偶联，得到2种人工合成抗原.人工合成抗原经过3次免疫实验动物小鼠，获得抗血清，抗血清经检测部分产生O型口蹄疫抗体，与对照组差异显著.

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(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-14；修回日期：2014-05-07

基金项目：甘肃省科技重大专项计划(1002NKDA039).

通信作者：刘艳红，女，博士，研究员，研究方向为病毒分子生物学.E-mail：liuyanhong@caas.cn

中图分类号：Q 516

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0035-05