CALR基因：慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)新分子标记物

CALR基因：慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)新分子标记物

[引著格式]周靖，黄知平.CALR基因：慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)新分子标记物[J].长江大学学报(自科版)，2015，12(30)：83~86.

周靖，黄知平(长江大学荆州临床医学院 荆州市中心医院血液内科，湖北 荆州 434020)

[摘要]慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)是骨髓中一系或多系髓系细胞增殖的克隆性造血干细胞疾病。近年来，多个分子标志物如JAK2、MPL基因突变等相继被发现，但仍有30%～45%的携有野生型JAK2/MPL的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)患者缺乏特异性分子标记物，诊断存在困难。近期新发现的钙网蛋白基因(CALR)突变将能填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标记物，对于理解CMPN的分子发病机制具有重要意义，对这类疾病进行诊断和治疗具有重要意义。

[关键词]慢性骨髓增殖性肿瘤；钙网蛋白基因(CALR)突变；分子标记物

骨髓增殖性肿瘤(CMPN)，既往称作骨髓增殖性疾病(MPD)，由于其具有肿瘤性特征，2008年WHO已用“慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)”代替“骨髓增殖性疾病(MPD)”[1,2]。真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)划为BCR-ABL融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤(CMPN)[1]。骨髓增殖性肿瘤是以分化相对成熟的一系或多系髓细胞过剩为特征的一类造血干细胞克隆性疾病，临床表现为易出血、血栓、骨髓纤维化、不同程度的髓外造血和白血病转化风险[2～4]。与骨髓增生异常综合征不同，CMPN伴随正常成熟和有效造血，脾脏肿大为其共同及常见症状。

2005年国外多个研究小组证实在97%的PV患者中发现了JAK2 V617F突变[5]，从而开创了分子诊断的“JAK2时代”[4,6]。随后，Pardanani等在ET及PMF患者中发现了MPL W515I突变，在PV患者中并未发现这一突变位点[7]。在这些分子标志物发现之前，虽然基于血常规、骨髓细胞学、骨髓活检等设计了一系列CMPN疾病诊断规则，但是在很多情况下，其血液、骨髓象等表现有明显重叠，难以准确诊断。随着JAK2 V617F、MPL W515、JAK2 exon12等基因突变的发现，CMPN的诊断有了突破性的进展[8]。研究证实约95%的PV和半数的ET/PMF存在JAK2 V617F突变，5%～10%的CMPN患者携带MPL或JAK2 exon12突变[4,7]。2008年WHO已经将JAK2和MPL突变列入诊断PV、ET和PMF的指标之一[9]。但仍有30%～40%的携有野生型JAK2和MPL的ET或PMF患者中尚未鉴定出特征性的基因异常，因此确诊仍有困难。2013年美国血液学会年会(ASH)上，英国剑桥Tefferi[10]和奥地利KLampfl等[11]同时报道在70%～80%的JAK2和MPL突变阴性的ET和PMF患者中存在钙网蛋白基因(CALR基因)突变，并证实CALR基因突变主要见于CMPN，很少见于MDS患者，为CMPN的特征性突变。联合检测JAK2、MPL和CALR基因突变，阳性率可达97%[10,11]。CALR基因的发现填补了JAK2/MPL突变阴性CMPN疾病分子生物学诊断的空白，作为有利的补充，CALR的发现对研究CMPN的分子发病机制、诊断及预后有着非常重要的意义，同时亦为治疗带来了新的靶位。

1CALR基因的功能结构

CALR蛋白位于内质网，是一种钙通道结合分子伴侣，是进化上高度保守的多功能蛋白，可协助蛋白质折叠并维持细胞内钙离子稳态，从而在体内发挥多种功能，参与免疫反应调节、细胞增殖调亡、细胞吞噬和纤维化过程[10]。CALR基因定位于染色体19p13.2，由3个蛋白结构域：N-结构域(残基1～180)、P-结构域(残基181～290)、C-结构域(残基291～400)和9个外显子组成。CALR基因突变是由于第9号外显子插入或缺失，从而导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种缺乏内质网保留序列(即KDEL氨基酸序列：Lys-Asp-Glu-Leu)的新型C-羧基末端的蛋白，CALR突变类型多样，其突变后C端氨基酸结构改变可能引起蛋白功能改变[10～12]。为了证实CALR基因突变确实导致了蛋白的改变，曾有研究运用免疫印记的方法证实了在人类HEK293T细胞CALR基因代表性结构中发现了CALR蛋白的异常表达。截至目前，已证实存在55种CALR基因突变体，其中最常见的两种变异体为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.L367fs*46)和由5个碱基TTGTC插入引起的2型变异体(p.K385fs*47)，约占所有突变类型的80%，缺失型(53%)多于插入型(32%)，缺失型中以del367fs46(37%)和del385fs47(71.4%)为主[10,11]。Vannucchi[13]等利用免疫组化技术检测携有CALR基因突变的骨髓活标本，发现免疫染色主要定位于巨核细胞上，说明巨核细胞在CALR阳性的CMPN疾病发病机制中发挥了重要作用。此外在一项体外研究中发现CALR的过度表达可以促进STAT5磷酸化作用并引起信号通道激活，这种激活作用可以被JAK抑制剂阻滞，说明了CALR与JAK2突变可能存在某种类似的机制[10,11]。但是由于目前对CALR基因突变的研究尚未深入，CALR基因如何激活JAK-STAT信号通路及其在CMPN疾病中的发病机制仍不清楚，有待进一步研究[14～16]。

2CALR基因突变的最新研究进展

2013年12月KLampfl等[11]和Tefferi等[10]两个研究团队同时报道了在JAK2/MPL阴性的ET和PMF中发现了钙网蛋白基因(CALR基因)突变，并证实CALR基因突变不发生于PV，仅见于JAK2/MPL阴性的ET和PMF。Klampfl等[11]采用全外显子测序的方法检测了1107例CMPN患者，JAK2/MPL阴性的ET和PMF的CALR基因检出率分别为67%和88%，并扩大研究了460例其他类型的血液肿瘤患者，包括254例AML、45例CML、73例MDS、64CMML、24例RARS-T，仅在RARS-T患者中检测到3例发生了CALR突变。Tefferi等采用同样方法检测了1356例样本，其中包括896例CMPN(382例PV、311例ET、203例PMF)和460例其他类型的血液肿瘤，同样证实CALR突变未见于PV，在CMPN阴性的ET/PMF中突变率为70%～84%，仅在MM患者中检测到8%的突变率，其余标本均未检测到CALR突变。此外，一项针对于258例PV、Post-PV MF和253例JAK2/MPL(+)的ET、PMF、Post-PV MF的研究[11]中均未发现CALR基因突变。近期，日本[17]和中国[18]的两个研究小组先后报道了在3例ET患者同时发生了CALR和JAK2基因的突变，CALR和JAK2的同时存在可能说明二者之间存在某种联系，比如患者本身的遗传倾向或一个基因突变后引起基因组不稳定从而导致另一突变的发生。但目前这种报道仅为个案，缺乏大宗病例，其发生机制有待研究。

2014年国外最新文献也对CALR突变最新研究进展进行了报道，Tefferi等[19]检测了1107例CMPN患者，PV中未检测到CALR突变，ET和PMF突变率分别为25%、35%；Rumi等[20]检测了1235例ET/PV患者，PV中未检测到CALR突变，ET突变率为13.6%；Rotunno等[21]检测了576例MPN患者，CALR突变检出率为15.5%。国外大宗病例报道CALR突变率基本一致，但目前为止亚洲地区仍尚缺大宗病例报道。Shirane等[17]检测了日本133名CMPN患者，ET和PMF的CALR基因检出率分别为19.6%和30.4%，与国外报道一致。付荣凤等[18]首次对中国的436例ET患者的研究发现，CALR基因突变率为22.7%。

3CALR基因突变的临床意义

研究表明，在JAK2/MPL阴性的ET和PMF患者中，CALR突变与其临床表现及预后有重要意义[13]。存在CALR突变的ET及PMF患者与JAK2/MPL阳性的患者相比较具有如下的临床表现特点：男性略多见、中位发病年龄较低、高血小板计数、低白细胞计数、低血红蛋白水平、低LDH水平、低DIPSS-PLUS风险积分、血栓事件发生率较低、心血管事件发生率较低、较少转化为骨纤及白血病、低输血依赖和拥有较高的生存率及预后。有文献报道，发生JAK2和CALR突变的心血管事件累计发生率分别为30.1%和13.5%，10年血栓累计发生率分别为14.5%和5.1%。并且国内外研究[17,18]指出，在ET患者中发生CALR基因2型突变的较之1型的血栓发生概率更低，在PMF患者中，发生1型突变的预后比2型预后好。发生CALR基因突变的PMF患者输血依赖为13%，与JAK2突变37%相比较明显偏低。此外，与JAK2突变的PMF患者相比较，发生CALR基因突变的PMF患者其剪接体突变发生率明显较低(8% vs 42%)[10～13]。为了论证CMPN其他相关基因突变与CALR突变的关系，Tefferi[26]等在254例CMPN标本中筛查了一些相关基因包括：EZH2、ASXL1、IDH、SF3B1、SRSF2和U2AF1等，并未发现它们与CALR突变存在任何显著的分子或遗传学关系。此项研究同时发现，JAK2/MPL/CALR三者均阴的CMPN患者预后较差，此外PMF患者预后还受ASXL1的影响，“CALR-ASXL1+”类型预后欠佳[12,15,17]。

4CALR基因突变的检测

CALR是CMPN中第2个最易发生突变的基因，因此有学者建议将其列为常规检测指标。CALR基因突变较为复杂多样，目前已证实有55种突变类型[17,18]，少见的突变类型增加了检测难度，CALR基因突变率可能被低估，因此对其检测要求高灵敏性及特异性。目前学者们较多采用基因测序方法进行检测，但测序方法价格昂贵，过程复杂，耗时较长，不利于临床快速诊断。基于CALR基因的临床重要意义，迫切需要更简单、快速、廉价的检测技术及方法。Vannucchi等[13]针对CALR突变体研制了一种多克隆抗体，将其用来免疫染色骨髓活检标本，此种方法快速简单，能有效区分发生CALR突变的ET和PMF患者，因此免疫组化可作为一个诊断工具。Chi Jianxiang等[23]研制出了一套PCR-HRM体系用于检测CALR突变，该体系完成检测仅需3h，操作简单易行，目前PCR技术已经较为成熟，临床实验室普及率高，此项体系可大大提高临床检测及诊断效率。

5CALR基因突变与CMPN诊断

CALR基因作为CMPN疾病较为特异的分子指标，作为对野生型JAK2/MPL的ET和PMF诊断的有力补充，对CMPN疾病诊断具有重要的意义[10,11,24]。目前已有较多学者建议将CALR基因检测纳入WHO诊断标准[12,15]。在CMPN临床诊断中，为避免不必要的检查和漏洞，可遵循以下诊断流程：①PV患者无需筛查CALR基因；②CALR与JAK2/MPL突变互为排斥，JAK2/MPL为阳性，无需筛查CALR基因；③对ET/MPL疑似患者，首先筛查JAK2基因突变，若为阴性，再行CALR基因突变筛查，若CALR基因突变仍为阴性，再筛查MPL突变；④仍有10% CMPN患者缺乏特殊分子标记，因此骨髓活检必不可少；⑤应将“CALR-ASXL1+”及“JAK2/MPL/CALR均阴”视为预后高危因素。

6展望

CALR突变的发现对进一步解释JAK2/MPL阴性的CMPN发病机制有着里程碑式的意义，因此我们有理由相信，CALR和JAK2/MPL一样将被WHO修订为CMPN的诊断指标，更期待这些基因突变作为靶向治疗的靶点，开启CMPN分子靶向治疗的新时代。

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[编辑]一凡

[中图分类号]R551.3

[文献标志码]A

[文章编号]1673-1409(2015)30-0083-04

通信作者：

[作者简介]周靖(1990-)，女，硕士生，主要从事血液肿瘤方向的研究工作；黄知平，15090727839@163.com。

[基金项目]湖北省科技厅科技计划项目(2009AA301C52)。

[收稿日期]2015-05-28