乌头碱对bcl-2基因表达影响作用的定量研究

饶朝龙，彭成

乌头碱对bcl-2基因表达影响作用的定量研究

饶朝龙，彭成

目的：研究乌头类中药对bcl-2基因表达的影响，探讨乌头类中药毒性作用机制。方法：建立荧光定量PCR反应体系；体外培养HepG2细胞，分别以500，100，50和10 μg．mL-1浓度的乌头碱作用于细胞，37℃染毒1.5 h，荧光定量PCR仪检测。结果：乌头碱作用下，bcl-2基因表达量增加，且不同剂量组呈现剂量-反应关系。结论：乌头类中药具有促进bcl-2基因表达的作用，可能是其毒效作用的重要因素。

乌头碱；bcl-2基因；毒性；定量

乌头类(Aconite)中药具有回阳救逆、补火助阳、温经止痛等功效。现代药理研究也证实其具有强心、抗炎、镇痛等多种药理作用，在临床上应用广泛。而其又乃有毒之品，临床应用和基础研究均表明其具有神经和心脏等毒性。以乌头碱（Aconitine，AC）为代表的双酯型二萜生物碱是乌头类中药的主要活性成分，具有显著的生理活性；但其同时也是引起毒性作用的主要成分。本课题组前期应用彗星试验研究表明，乌头碱对细胞DNA具有损伤作用，提示其具有遗传毒性作用[1]。大量文献报道提示乌头碱与细胞凋亡有关，而bcl-2基因被认为是细胞凋亡发生过程中最重要的调控基因之一。基于凋亡发生过程及其机制的复杂性，本研究拟采用实时荧光定量PCR技术定量分析在乌头碱作用下bcl-2蛋白表达的变化情况，以进一步明确其作用模式和结局通路[2]，探讨乌头类中药的毒性作用机制和特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝肿瘤细胞系HepG2 细胞，由四川大学华西基础医学与法医学院分子生物学实验室保存并提供。

1.1.2 受试药品和试剂 乌头碱，质量分数为98.00%，购于中国药品生物制品检定所；TRIZOL试剂，invitrogen公司；iScriptTM cDNA Synthesis Kit，BIO-RAD公司。

1.1.3 主要仪器 Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪。

1.2 实验方法

1.2.1 HepG2细胞的培养 以改良的Dubico培养基常规传代培养HepG2细胞。收获进入对数生长期的细胞，将细胞密度调整为2×105～5×105个/mL，接种于24孔板，1 mL/孔。

1.2.2 RNA提取及质量分析 提取细胞总RNA。其完整性分析用1%非变性琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察；GE NanoVue超微量分光光度计进行纯度分析。

1.2.3 cDNA第一链合成 按照TaKaRa反转录酶M-MLV操作说明进行RT-PCR，以所得总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，反应体系如表1。先将Oligo(dT)18和RNA混匀，用DEPC水将体积补充至6 μL，在PCR仪上70℃，变性10 min取出冰浴2 min后短暂离心，在冰上加入提前配制好的其余混合物。混合均匀后再次放入PCR仪42℃反应1 h，70℃反应10 min，存于-20℃备用。

表1 RT-PCR反应体系

1.2.4 实时荧光定量PCR

根据NCBI公布的基因全长分别设计bcl-2F/ bcl-2R作为荧光定量PCR引物，bcl-2 F：ATCGCCCTGTGGATGACTGA；bcl-2 R：CCAGGAGAAATCAAACAG

AGGC；选取actin作为内参基因，引物为ActF和ActR，ActF：TCCACGAAA

C T A C C T T C A A C T C C；A c t R：ATGGTGGTGCCGCCAGACA。

利用RNA提取试剂盒从目的材料中提取高质量的Total RNA，所得RNA使用BIO-RAD公司的iScriptTM cDNA Synthesis Kit进行反转录，在PCR仪上25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min，所得cDNA用Nuclease-free water 稀释10倍，-20℃保存备用。

荧光定量PCR 所用试剂盒为BIO-RAD 公司的SsoFastTM EvaGreen ®Superemix，具体体系如表2所示，反应程序为 95℃变性2 min后，进入95℃ 10 s，60℃1 min的45个循环，最后从65℃到95℃进行溶解曲线分析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增。每个样品均重复三次以避免加样误差，实验数据利用iQ5-Cycler进行分析，分析方法为ΔΔCt法。

表2 荧光定量PCR反应体系

1.2.5 乌头碱处理细胞 待接种细胞生长至对数生长期后，加入乌头碱，使受试物染毒终浓度分别为500 μg．mL-1，100 μg．mL-1，50 μg．mL-1和10 μg．mL-1，置37℃孵箱染毒1.5 h。

1.2.6 乌头碱处理后bcl-2基因表达水平检测 提取Total RNA，反转录后按上述方法进行实时荧光定量PCR。所得数据采用SPSS18.0进行统计分析。

2 结果

2.1 细胞总RNA的质量分析

图中RNA条带清晰，亮度高，无弥散带，提取的RNA质量好，可用于后续实验。

图1 细胞Total RNA的琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 实时荧光定量检测体系的建立

引物的扩增曲线（Ct值在15～30之间）、溶解曲线（为单一主峰）以及标准曲线（相关系数达到0.99）均符合实验要求，可以用于后续实验。

图2 引物扩增曲线、溶解曲线和标准曲线

A、B分别为bcl-2和actin基因定量引物的扩增曲线、溶解曲线和标准曲线

2.3 不同剂量乌头碱作用下bcl-2基因的表达分析

与阴性对照组相比，乌头碱作用组细胞的bcl-2蛋白表达量增加（p＜0.05），且不同剂量组呈现出剂量-反应关系。

图3 不同剂量乌头碱作用下bcl-2蛋白的表达量

3 讨论

bcl-2基因属于bcl-2基因家族，是一种重要的细胞凋亡抑制基因，在多种类型细胞凋亡的调控方面起着重要作用[3]。基因转染实验已证实，bcl-2基因处于凋亡调控的终末部分，其表达的Bcl-2蛋白可能阻止DNA损伤后激活凋亡机制的信号到达其靶位，中断凋亡感应子和效应子阶段的联系，因而Bcl-2蛋白的过表达会打破细胞的自稳平衡机制，产生凋亡抑制作用，从而使得受损或突变细胞不能得到及时的清除和修复[4]。

乌头碱是乌头类中药的代表性毒性成分和有效成分之一，其毒性研究对于探讨乌头类中药的毒效相关性具有重要意义。应用荧光定量PCR技术可以较好地反映凋亡相关因子表达的变化[5]，本研究采用荧光定量PCR技术检测表明，乌头碱可以使bcl-2基因的表达量增加，且不同剂量组呈现出明显的剂量-反应关系，与本课题组前期采用流式细胞术的检测结果一致。流行病学理论认为剂量-反应关系的存在对于因果联系的推断具有积极意义。本结论进一步证实乌头类药物具有促进bcl-2基因表达的作用，细胞凋亡的抑制作用增强，从而使得损伤无法通过凋亡的主动途径被修复并得以固定下来，从而产生细胞形态和功能的进一步损伤。此外，本课题组还研究了乌头类生物碱对ras基因、p53基因等凋亡相关基因的作用。上述研究结果将有助于进一步明确乌头类中药的毒效作用模式和结局通路。

由于人肝细胞系HepG2细胞具有和人类相似的代谢能力，可作为化学物短期体外遗传学评价常规试验的指示细胞，因而，欧盟等机构均认为，在体外试验中使用HepG2细胞可以得到模拟体内实验的结果，其结果用于评价DNA损伤作用时更具实际意义。目前已在体外试验研究中得到了广泛的应用[6]。

[1] 饶朝龙,彭成.应用彗星试验检测乌头类生物碱致细胞DNA损伤作用[J].中药与临床,2010,1(2):36.

[2] 周宗灿.毒作用模式和有害结局通路[J].毒理学杂志,2014, 28(1):1.

[3] 王晓辉,朱玉真.硫酸镍诱导小鼠卵巢细胞P53、P16、Bcl-2蛋白表达的研究[J].毒理学杂志,2008,22(5):377.

[4] Thompson CB.Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disease[J].Science,1995, 267(12):1456.

[5] 孙云峰,王浩,蒋宁,等.消痈溃得康对胃溃疡模型大鼠生长因子和凋亡相关因子的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19 (5):186.

[6] 单蕾,范雪梅,王义明,等.中药复方四味肝泰对荷瘤小鼠和HepG2肝癌细胞的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2012,14(2):1428.

（责任编辑：陈思敏）

Quantitative study on the effect of aconitine on the expression of bcl-2 gene

RAO Chao-long, PENG Cheng // (School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To study the effect of aconitic alkaloid on the expression of bcl-2 gene, and explore the mechanism of toxicity.Method:The reaction system of Q-RT-PCR was established. HepG2 cell was cultivated in vitro, then treated with aconitine (500，100，50 and 10 μg．mL-1) respectively for 1. 5 h at 37℃. And then the cell was determined with Q-RT-PCR.Result:After treated by aconitine, the amount of expression of bcl-2 gene was increased significantly. And its dose-response relationship was observed.Conclusion:Aconitic alkaloid plays an important role in promoting bcl-2 gene expression which may be the mechanism of aconitic toxicity.

Aconitine; bcl-2 gene; toxicity; quantifcation

R 285.5

A

1674-926X(2015)04-005-03

国家重点基础研究发展计划（2012CB723502）；四川省科技厅重点项目（2012JYZ006）；四川省教育厅重点项目（12ZA044）；四川省科技厅“中药药理四川省青年基金科技创新研究团队”（2014TD0007）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

饶朝龙，男，教授，主要从事中药毒理学研究Email：raochaolong@sina.com.cn

彭成，教授，博士生导师，主要从事中药毒理学研究 Email：pengchengchengdu@126.com

2015-02-15