褐藻糖胶对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226中Wnt/β-catenin通路的影响研究

李 燕,李 静,阎桂艳,罗建民,郝洪岭,王素云,李 杰,杨 洁,袁 军,王瑞仓,张培军

(1. 河北省人民医院,河北 石家庄 050000；2. 河北省中医院，河北 石家庄 050011；3. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；4. 河北省高碑店市医院，河北 高碑店 074000)

褐藻糖胶对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226中Wnt/β-catenin通路的影响研究

李 燕1,李 静2,阎桂艳1,罗建民3,郝洪岭1,王素云1,李 杰1,杨 洁1,袁 军1,王瑞仓1,张培军4

(1. 河北省人民医院,河北 石家庄 050000；2. 河北省中医院，河北 石家庄 050011；3. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；4. 河北省高碑店市医院，河北 高碑店 074000)

目的 探讨褐藻糖胶诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡过程中Wnt/β-catenin通路的变化。方法 应用褐藻糖胶诱导多发性骨髓瘤细胞株RPM18226的凋亡，观察多发性骨髓瘤细胞株经10，25，50，100 μg/mL浓度褐藻糖胶分别作用24，48，72 h后细胞增殖抑制率。将细胞分为3组：空白组不予药物干预，褐藻糖胶组给予25 μg/mL褐藻糖胶培养，Wnt通道抑制剂(DKK-1)组给予DKK-1培养。用AnnexinV-FITC/PI双染法检测3组RPMI822细胞凋亡率，通过Western blot方法检测3组β-catenin与c-myc蛋白表达情况。结果 随褐藻糖胶浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖抑制率明显增高(P均<0.05)。褐藻糖胶组细胞凋亡率明显高于空白组；褐藻糖胶组和DKK-1组β-catenin 和 c-myc 蛋白表达水平均明显低于空白组(P均<0.05)，褐藻糖胶组与 DKK-1组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论褐藻糖胶能够诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226发生凋亡，与DKK-1作用相当，并且褐藻糖胶能够有效抑制多发性骨髓瘤细胞株中Wnt/β-catenin通路的活化状态，为有效治疗多发性骨髓瘤患者提供了理论依据。

褐藻糖胶；多发性骨髓瘤细胞RPMI8226；Wnt/β-catenin通路；β-catenin

多发性骨髓瘤是一种来源于终末分化的B淋巴细胞的恶性血液病，其特点为浆细胞异常增生，可引起骨质、肾脏等靶器官的损害，从传统的化疗到联合造血干细胞移植，缓解率虽然取得了一定的成效，但复发率仍较高，临床治疗效果仍然不理想，从而需要积极寻找有效的治疗方法。目前有研究证实了多发性骨髓瘤细胞系及多发性骨髓瘤患者骨髓中高表达 β-catenin, 且在体外证实了 Wnt/β-catenin 信号通路有调节多发性骨髓瘤细胞增殖和侵袭的作用[1]。Wnt/β-catenin通路是始终在生物进化中保持高度保守的信号通路，恶性肿瘤的发生、发展往往与此通路密切相关。褐藻糖胶是一种天然的复合多糖，其分子链末端含有天然的硫酸基。近年研究发现褐藻糖胶具有抗凝血、 抗动脉硬化、 抗辐射、 抗肿瘤、 抗病毒及免疫调节等多种生物活性，其可以诱导癌细胞凋亡，可用作癌细胞凋亡诱导剂[2]。Yasui等[3]研究发现，褐藻糖胶能够起到诱导多发性骨髓瘤细胞株凋亡、抑制增殖等作用。但目前有关褐藻糖胶对Wnt/β-catenin通路的影响研究较少。本研究通过观察褐藻糖胶诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡情况及对Wnt/β-catenin通路的相关靶基因c-myc的影响，探讨了褐藻糖胶诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制，现报道如下。

1 实验资料

1.1 材料与试剂 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226(河北医科大学第二医院血液病研究所长期保存细胞系)， 99%的褐藻糖胶、MTT检测试剂(美国Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，V-FITC/PI凋亡试剂盒以及蛋白提取剂(南京凯基生物科技发展有限公司)，β-catenin兔抗人抗体(美国Santa cruz公司)，电子天平(德国Sartorius)，超净工作台(北京半导体设备一厂)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，β-actin鼠抗人抗体(美国Santa cruz公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和鼠抗兔二抗(北京中山公司)，微型高速离心机(德国Eppondoff公司)，-80 ℃的冰箱(日本SANYO公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，DKK-1wnt通路抑制剂(北京中山公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞增殖抑制率的检测 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226培养于含10%灭活小牛血清、100 IU/mL青霉素及100 μg/mL硫酸链霉素的RPMI1640培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，每3 d换液传代1次。细胞经传代4次后，取对数生长期的RPMI8226细胞株，以1×109L-1接种于96孔培养板中，每孔100 μL。每孔加入终浓度分别为10，25，50，100 μg/mL的褐藻糖胶溶液10 μL，每组3个复孔，在37 ℃、5%CO2条件下孵育24，48，72 h后，每孔中加入2 mg/mL MTT，在37 ℃下继续培养4 h，小心吸弃上清，每孔中再加入10% DMSO 150 μL 终止反应,待结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪于570 nm测定各孔吸光度OD值。细胞生长抑制率=(1-实验组OD)/对照组OD×100%。

1.2.2 细胞凋亡率的检测 用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。取对数生长期的RPMI8226细胞株，制成0.5×109L-1单个细胞悬液。将细胞分为3组：空白组不予干预，褐藻糖胶组以25 μg/mL的褐藻糖胶培养，DKK-1组以DKK-1培养。在37 ℃、5% CO2条件下培养72 h，收集细胞液，离心3 min，抛弃培养基，使用PBS溶液清洗3次，将细胞放置于500 μL的混悬液中，加入5 μL的PI溶液以及Annexin V/FITC溶液，吹打均匀后，冰上、避光条件下反应10 min，于1 h内送流式细胞仪检测，所有实验均需要重复3次。

1.2.3 β-catenin与c-myc蛋白的测定 取对数生长期的RPMI8226细胞株，制成0.5×109L-1单个细胞悬液，接种于5 mL培养瓶中。将细胞分为空白组、 DKK-1组(终浓度为100 ng/mL)及褐藻糖胶组(终浓度为25 μg/mL，1/2 IC50值)，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养72 h后， 收集对数生长期细胞，168 g离心3 min，PBS洗涤3次； 按照细胞总蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白，BCA法进行蛋白定量测定。 每组取30 μg蛋白质样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST稀释一抗β-catenin(1∶200)、c-myc(1∶200)。膜与一抗4 ℃孵育过夜， TBST洗膜3次， 孵二抗(均为1∶4 000)， 二抗室温下孵育1.5 h， TBST洗膜3次， ECL显色， 定影， 实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以表示，比较采用t检验，计数资料采用2检验，并以率(%)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞增殖抑制情况 褐藻糖胶对于多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制作用呈现出时间-剂量的变化，随浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖抑制率明显增高(P均<0.05)。作用72 h各浓度间的抑制率均高于24 h、48 h(P均<0.05)。见表1。

表1 细胞增殖抑制情况

注：①与72 h比较，P<0.05。

2.2 细胞凋亡情况 褐藻糖胶组凋亡率为15.28%，空白组为6.28%，DKK-1组为13.35%。褐灌糖胶组和DKK-1组凋亡率均明显高于空白组(P均<0.05)。

2.3 β-catenin与c-myc蛋白水平比较 作用72 h后，褐藻糖胶组和DKK-1组β-catenin和c-myc蛋白表达水平均明显低于空白组(P均<0.05)，褐藻糖胶组与DKK-1组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 3组β-catenin与c-myc蛋白水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05。

3 讨 论

褐藻糖胶是从海带中提取和纯化的多糖类制剂，由岩藻糖和硫酸基组成，主要分子结构为 α-L-岩藻糖-4-硫酸酯。褐藻糖胶可通过多条信号通路诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移，但对不同的肿瘤细胞作用机制有所不同[4]。褐藻糖胶能够显著抑制细胞外基质降解酶对于内皮下细胞外基质的降解作用，从而抑制肿瘤细胞的远处迁移[5]。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用，它是Wnt信号通路传导的经典途径。其中β-catenin是Wnt/β-catenin信号传导通路中的关键作用分子,它的过度表达与肿瘤发生、发展关系紧密，其通过特有的方式能够让一种重要的信号分子参与到细胞异常增殖的过程中，从而导致患者肿瘤的形成[6]。β-catenin同时也是一种原癌基因，其有较多种功能的细胞骨架蛋白，能够与E-钙黏蛋白相互作用，从而使同种类型的细胞进行黏附，并且在患者肿瘤转移以及对患者进行侵袭的过程中起重要作用。另外β-catenin是Wnt经典信号转导通道的重要信号因子,它可以进入细胞核内与转录因子Lef/Tcf结合，并且启动下游靶基因的转录，从而促进恶性肿瘤细胞的增殖、浸润,并且进一步促进新生血管形成,抑制细胞凋亡[7]。相关的靶基因有c-myc、CCND1、MMP-7和WISPI等，这些相关基因参与了许多恶性肿瘤的形成与发展。

在肿瘤细胞中，Wnt/β-catenin信号通路可以诱导各种生长因子及其受体的表达(如c-met酪氨酸激酶)，从而进一步调节肿瘤细胞增殖；它能够上调抗凋亡蛋白(如caspase抑制剂、Survivin)，并能进一步抑制肿瘤细胞凋亡；同时能通过上调血管内皮生长因子进而刺激血管增殖；同时也上调细胞外基质降解蛋白 MMP-7、MMP-26，并促进肿瘤细胞的进一步远处侵袭和转移[8-10]。在许多恶性血液病中，发现了Wnt/β-catenin 通路的异常激活，主要见于多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性白血病等，这一通路对肿瘤细胞具有重要的促进增殖等作用[11]。

王宁等[12]研究表明，褐藻糖胶能够诱导骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡，同时也能够明显抑制Wnt信号通路的关键效应分子的表达。Bjorklund等[13]研究显示，褐藻糖胶通过抑制Wnt信号通路的相关基因表达，从而诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226出现凋亡，说明褐藻糖胶有显著抗肿瘤作用。本研究发现，褐藻糖胶作用于多发性骨髓瘤RPMI8226细胞，增殖抑制作用呈现出时间-剂量的关系；多发性骨髓瘤细胞经过褐藻糖胶25 μg/mL处理72 h后，β-catenin和c-myc蛋白表达水平均明显降低，其作用与Wnt/β-catenin抑制剂相似。提示褐藻糖胶能够明显抑制Wnt/β-catenin通路和β-catenin蛋白、c-myc蛋白的表达，从而抑制一系列的细胞信号传导，进而抑制肿瘤细胞的增殖及分化、转移等细胞活动，可能对多发性骨髓瘤患者的治疗及预后有非常积极的临床意义。当然，褐藻糖胶也可能通过其他的信号通路及信号传导抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、转移等，有待于深入研究。

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Study on the effect of fucoidan on Wnt/ β-catenin pathway in multiple myeloma cell line RPMI8226

LI Yan1, LI Jing2, YAN Guiyan1, LUO Jianmin3, HAO Hongling1, WANG Suyun1, LI Jie1, YANG Jie1, YUAN Jun1, WANG Ruicang1, ZHANG Peijun4

(1.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 2.Hebei Province Hospital of TCM, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 3.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 4.Hospital of Gaobeidian City, Gaobeidian 074000, Hebei, China)

Objective It is to investigate the changes of Wnt/β-catenin pathway in apoptosis of fucoidan induced multiple myeloma cell line RPMI8226. Methods The apoptosis of multiple myeloma cell line RPMI8226 was induced by fucoidan, then the inhibiting rate of proliferation of the cells were observed after induction for 24, 48 and 72 h with 10, 25, 50, 100 μg/mL of fucoidan. The cells were divided into 3 groups: blank group was given no intervention of medicine, fucoidan group was given 25 μg/mL for culture, Wnt channel inhibitor (DKK-1) group was given DKK-1 for culture. Apoptosis rate of RPMI822 cells in the three groups were detected by AnnexinV-FITC/PI double staining method, and the expression of β-catenin and c-myc protein was detected by Western blot method. Results With the increase of concentration and effect time of Fucoidan, the inhibition rate of proliferation of multiple myeloma cells increased signficantly (P<0.05). The apoptosis rate of fucoidan group was obviously higher than that in the blank group; the levels of expression of β-catenin and c-myc protein in fucoidan group and DKK-1 group were significantly lower than that in blank group (P<0.05), but there was no significant difference in the levels between fucoidan group and DKK-1 group(P>0.05). Conclusion Fucoidan can induce the apoptosis of multiple myeloma cell line RPMI8226, the effect is similar to DKK-1, and it can effectively inhibit the activation status of Wnt/β-catenin pathway, this may provide some theoretical evidences for the treatment of multiple myeloma.

fucoidan; multiple myeloma cell line PTMI8226; Wnt/β-catenin pathway; β-catenin

李燕，女，主治医师，硕士，研究方向为恶性血液病的诊治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.007

R-33

A

1008-8849(2015)23-2530-03

2015-01-18