依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马氨基酸递质通路的影响

李 飞，成祥林

(长江大学临床医学院/湖北省荆州市第一人民医院，湖北 荆州 434000)

依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马氨基酸递质通路的影响

李 飞，成祥林

(长江大学临床医学院/湖北省荆州市第一人民医院，湖北 荆州 434000)

目的 探讨依达拉奉对戊四氮(PTZ)致痫大鼠海马氨基酸递质通路的影响。方法 将36只成年Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、模型组(M组)和依达拉奉组(E组)，观察3组大鼠的行为学和脑电图情况，应用免疫组织化学方法测定各组大鼠海马γ-氨基丁酸转运体和谷氨酰胺合成酶的含量。结果 与M组相比，E组大鼠癫痫发作程度和脑电图改变以及海马γ-氨基丁酸转运体的含量均明显下降(P均<0.05)，而谷氨酰胺合成酶的含量则明显升高(P<0.05)。结论 依达拉奉可通过降低癫痫大鼠海马γ-氨基丁酸转运体含量和增强谷氨酰胺合成酶表达以达到对抗癫痫的效果。

癫痫;戊四氮;依达拉奉;大鼠

依达拉奉是目前发现有效的自由基清除剂，临床发现其具有较好的抗癫痫作用，但是其深层的作用机制还不是很清楚。本研究旨在通过观察依达拉奉对戊四氮(PTZ)致痫大鼠行为学、脑电图及海马γ-氨基丁酸转运体(GAT)和谷氨酰胺合成酶(GS)的影响，探讨依达拉奉抗癫痫的深层机制，并反证自由基与氨基酸递质在癫痫发病中的相互作用机制，为癫痫的治疗和预防提供新的途径。

1 实验资料

1.1 仪器与试剂 PTZ及多聚甲醛均为Sigma公司产品，兔抗GAT和GS抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔抗体和DAB染色剂由迈新公司提供，依达拉奉由南京先声药业有限公司生产。

1.2 动物的分组与处理 清洁级健康雄性Wistar大鼠36只，体质量280～340 g,武汉大学动物实验中心提供，合格证号：[E]2008-005。随机分为正常对照组(NC组)、模型组(M组)和依达拉奉组(ED组)，每组12只。实验动物饲养于正常昼夜环境中，正常进食水。

1.3 动物模型制备及脑电图记录 清醒状态下将大鼠固定，采用头皮针电极、双极导联法(额-顶)连接。电极分别取两眼连线中点(额叶)及两耳连线中点(顶叶)插入固定,鼻根部接地线。M组与ED组大鼠腹腔注射PTZ 60 mg/kg制作癫痫模型[1]，NC组注射等剂量的生理盐水,观察3组大鼠行为表现。ED组在造模前1 h、0.5 h、造模即刻分别予以注射依达拉奉3 mg/kg[2]，M组与NC组予以等量生理盐水代替。3组完成注射后均观察1 h并记录脑电图。

1.4 行为学观察 参照Racine癫痫发作行为标准[3]进行观察记录。Ⅰ级：面肌抽动；Ⅱ级：节律性动头；Ⅲ级：前肢抽搐；Ⅳ级：躯干及前肢阵挛，Ⅴ级：四肢抽搐，全身阵挛。

1.5 标本采集、处理及指标测定 观察1 h后，3组大鼠均行心脏灌注固定，断头取脑，大鼠脑组织(含海马)常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚度4 μm)。每只鼠随机选取4张切片，这些切片的断面水平在各鼠均相似。每只大鼠选择4张脑片，2张用于GAT的检测，2张用于GS的检测，应用免疫组织化学方法(S-P法，按说明书进行)测定3组大鼠海马GAT和GS的阳性神经细胞数和阳性反应细胞平均吸光度，每张切片的每个区域随机选择3个高倍视野进行测定。对所选脑区运用HPIAS-200型图像分析软件进行阳性反应细胞平均度和阳性神经细胞数分析。阳性反应为棕色颗粒，颜色越深，吸光度值越大。

2 结 果

2.1 行为变化M组大鼠给药以后平均56s左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中9只出现Ⅴ级发作，2只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作。ED组大鼠给药以后平均12min左右出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中1只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作，7只出现Ⅱ级发作，3只出现Ⅰ级发作。NC组给药前后均无明显变化。

2.2 脑电图变化NC组大鼠脑电图表现为α或β波；M组鼠均出现阵发性痫性放电,表现为高电位的棘波、尖波、棘- 慢复合波、尖-慢复合波；ED组部分大鼠有尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波出现。见表1。

表1 3组大鼠脑电图表现比较 只

2.3 免疫组织化学结果ED组海马GAT阳性细胞数和光密度较M组降低(P均<0.01)，但较NC组增高(P均<0.05)；ED组海马GS阳性细胞数和光密度较M组升高(P均<0.01)，但较NC组降低(P均<0.05)。见表2。

3 讨 论

表2 3组海马GAT和GS阳性细胞数和阳性反应细胞平均吸光度

注:①与M组比较，P<0.01;②与NC组比较,P<0.05。

癫痫是大脑神经元的突发性异常发电的短暂一过性大脑功能障碍的慢性疾病，其发病机制复杂，目前尚未完全清楚。多数研究证明癫痫动物模型或临床癫痫患者中存在着中枢性氨基酸递质的变化，通过局部或全身调节氨基酸含量可以诱发或抑制癫痫发作，提示氨基酸递质在癫痫发病中起着重要作用[4]。谷氨酸是中枢内重要的兴奋性神经递质，其导致的神经元兴奋性活动由不同的亚型受体介导[5]。GS是中枢神经系统中调节谷氨酸代谢的重要酶之一，它催化谷氨酸转化为谷氨酰胺[6]，降低谷氨酸含量。GS与癫痫的形成有关系，其机制可能为：GS表达减少或活性降低，谷氨酸向谷氨酰胺的转化减少，引起细胞外液中的谷氨酸堆积，从而改变影响了神经元的功能，最后导致了癫痫的形成[7]。在本实验中也发现，NC组的GS含量较M组明显增高，这也进一步证实了GS在癫痫发病中的作用；同时在中枢神经系统还存在抑制性氨基酸[γ-氨基丁酸(GABA)]，许多神经生理学研究提示GABA介导的抑制性传导异常或缺失是癫痫发作时神经元高兴奋性的主要原因[8]。GAT介导GABA的摄取和灭活，调节GABA能神经传导，是GABA介导的抑制性传导的生化基础。GAT含量的增高必将导致突触间隙GABA的减少，参与癫痫的发病过程，本实验发现NC组的GAT含量较M组明显降低，进一步佐证了GAT参与了癫痫的发病过程。

动物实验发现癫痫发作会导致自由基产物增多,并会损伤细胞蛋白、脂质和DNA,线粒体在癫痫导致的自由基增多中起重要作用[9]。在癫痫急性发作的病理过程中大脑内产生的活性氧和超氧化物的量大大增加,过量产生的自由基通过灭活谷氨酰胺合成酶来促进兴奋性神经递质谷氨酸的异常增加,使其在细胞外蓄积产生兴奋性神经毒性。而兴奋性氨基酸类神经递质(EAAs)在癫痫持续状态和慢性癫痫所致的神经元损伤发生中起重要作用[10]。氧化应激和线粒体功能障碍参与了神经元死亡和癫痫发作。并且在癫痫发生过程中起重要作用[11]。目前认为，依达拉奉作为一个有效的自由基清除剂，其神经保护效果是通过抑制脂质过氧化实现的[12]。有证据表明，抗氧化剂治疗可以减少诱导氧自由基在一些动物惊厥模型的病变[13]。

本研究结果表明依达拉奉可以明显延长癫痫的发作潜伏期、降低发作程度,减少脑电图癫痫波的发放，说明自由基清除剂依达拉奉可以帮助控制癫痫的发作；而同时ED组中大鼠海马组织中GAT减少，提示依达拉奉可能通过抑制自由基的产生和配套的抗氧化还原系统的保护作用[14],或间接增加抑制性神经递质GABA而控制癫痫发作，从而降低癫痫的致残率和病死率,对癫痫治疗有益,值得临床上推广使用。但依达拉奉不能完全拮抗癫痫，可以作为癫痫的辅助治疗。

综上所述,癫痫活动伴有活跃的自由基反应,清除自由基,阻断自由基反应给癫痫的预防和治疗开辟了新的领域。由于引起癫痫的因素是多方面的,单纯使用自由基清除剂治疗癫痫难以达到理想的效果,还需与抗癫痫药物联合应用。但笔者可以预见,进一步探索癫痫发生的自由基病理机制,开发有效清除自由基的药物具有广阔的前景。

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Effects of edaravone on the amino acid neurotransmitter pathway from the hippocampus in pentylenetetrazol-induced epileptic rats

LI Fei, CHENG Xianglin

(Clinical Medical College of Changjiang University/The First People’s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,Hubei,China)

Objective It is to investigate the effects of edaravone on the amino acid pathway from the hippocampus in pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats. Methods 36 adult Wistar rats were randomly divided into normal control group(NC group), epileptic model group(M group) and edaravone group (ET group). The changes of behavior and EEG were observed in rats of the three groups. The expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter and glutamine synthetase at protein level was detected by immunohistochemistry. Results Compared with that in M group, epileptic degree and EEG changes and the expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter was significantly decreased (P<0.05), while the expression of glutamine synthetase was significantly increased in ET group(P<0.05).Conclusion Edaravone could ameliorate epilepsy via a decrease of the expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter and an increase of the expression of glutamine synthetase in pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats.

epilepsy; pentylenetetrazole; edaravone; rat

李飞，男，主治医师，研究生在读，研究方向为急危重症。

成祥林，E-mail：cheng066@tom.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.008

R-332

A

1008-8849(2015)23-2533-03

2014-06-25