乌司他丁对急性百草枯中毒大鼠血浆中炎性细胞因子及MDA、SOD影响的研究

王 鑫，李 兵，孙桂芹，李爱军，陈 宁

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056002)

乌司他丁对急性百草枯中毒大鼠血浆中炎性细胞因子及MDA、SOD影响的研究

王 鑫，李 兵，孙桂芹，李爱军，陈 宁

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056002)

目的 观察乌司他丁对急性百草枯中毒大鼠血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6水平及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响，探索急性百草枯中毒导致组织器官损伤的机制。方法 将126只SD健康成年大鼠随机分为对照组、染毒组、治疗组，染毒组和治疗组分别给予腹腔内一次性注射百草枯25mg/kg染毒, 之后治疗组腹腔内注射乌司他丁3×104μg/kg,每天1次，对照组和染毒组注射等量生理盐水。3组于干预后1，3，7，14，21，28，35d各取6只，观察比较血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及MDA含量、SOD活力。结果 染毒后1，3，7，14，21d，染毒组TNF-α水平明显高于对照组(P均<0.01)；染毒后3，7，14，21，28，35d，染毒组IL-1β水平明显高于对照组(P均<0.01)；染毒后7，14，21，28，35d，染毒组IL-6水平明显高于对照组(P均<0.01)。相应时段治疗组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于染毒组，但仍高于对照组。染毒后1d血浆MDA含量急剧上升，以后各时段呈逐渐下降趋势，1，3，7，14，21d明显高于对照组(P均<0.01)，同时段治疗组MDA含量较染毒组明显降低(P均<0.05)，但1，3，7d明显高于对照组(P均<0.01)。染毒后1d,染毒组血浆SOD活力即明显下降，以后各时段呈逐渐上升趋势，1，3，7d明显低于对照组(P<0.01)，14d和21d时仍低于对照组(P均<0.05)；治疗组各时段SOD活力均较染毒组明显升高(P均<0.01)，但1d与3d时明显低于对照组(P均<0.01)，7d时仍低于对照组(P<0.05)。结论TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD在急性百草枯中毒大鼠血浆中的含量发生改变，它们可能参与了百草枯导致组织器官损伤的过程；乌司他丁治疗后各指标均发生了变化，可能与乌司他丁较强的抗氧化、抑制炎症递质释放等功能有密切关系。

百草枯；中毒；细胞因子；乌司他丁

百草枯(PQ)是当前世界范围内应用极为广泛的除草剂，随着其在我国农业上的推广应用，PQ中毒也日渐增多，其对人和动物的毒性很高，其口服中毒病死率为50%～70%[1]。PQ可以经消化道吸收、呼吸道吸入以及皮肤接触等途经进入体內，导致急性中毒。目前PQ中毒尚无特效解毒药物，其发病机制也尚未完全清楚，因此PQ中毒所造成的机体生理病理改变成为目前中毒治疗学研究的热点。本研究旨在通过分析急性PQ中毒大鼠模型血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6水平及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及乌司他丁(ulinastatin,UTI)对各指标的影响，探讨急性PQ中毒导致组织器官损伤的机制以及乌司他丁对其的治疗作用。

1 实验资料

1.1动物 清洁级成年健康SD大鼠126只，雌雄不拘，体质量270～300 g,购自河北医科大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(冀)2011-0004。

1.2 材料及试剂 20%PQ溶液(英国先正达股份有限公司生产)，乌司他丁(广东天普生化医药有限公司，国药准字Z68240509)，TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒均由美国Rapidbio(R&B)公司生产， SOD及MDA检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 动物分组及模型制备 将126只SD大鼠随机分成对照组、染毒组、治疗组，每组42只。染毒组及治疗组腹腔内一次性注射PQ 25 mg/kg建立中毒模型，对照组注射等量生理盐水。之后治疗组腹腔内注射乌司他丁3×104μg/kg,每天1次，染毒组和对照组腹腔内注射等量生理盐水，均直至留取标本。

1.4 取材及样品制备 3组在干预后1，3，7，14，21，28，35 d清晨空腹各取出6只，行乙醚麻醉后，分别从腹主动脉采集非抗凝血1 mL，低温下3 000 r/min离心15 min，取上清液，分装于干燥的EP管中，放入-80 ℃冰箱冷冻存放。用ELISA法检测血浆TNF-α、IL-1β、IL-6水平。采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定血浆中MDA含量。采用黄嘌呤氧化酶法检测血浆中总SOD(T-SOD)的活力。

2 结 果

2.13组血浆TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 染毒后1～21 d，染毒组TNF-α水平明显高于对照组(P均<0.01)，此后TNF-α水平下降，与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；治疗组相应时段TNF-α水平均低于染毒组(P均<0.05)，但仍高于对照组(P均<0.01)。染毒组IL-1β从3 d开始升高，7 d达到高峰，此后维持在较高水平，3，7，14，21，28，35 d均高于对照组(P均<0.01)，同时段治疗组IL-1β水平均低于染毒组(P<0.01或P<0.05)，但3，7，14，21 d水平高于对照组(P均<0.01)，其余时段比较差异无统计学意义(P均>0.05)。染毒组IL-6水平升高时段较晚，从7 d开始升高，21 d达到高峰，此后维持在较高水平，7，14，21，35 d均高于对照组(P均<0.01)，同时段治疗组IL-6水平均低于染毒组(P均<0.05)，但仍高于对照组(P均<0.01)。见表1。

2.2 3组MDA含量和SOD活力比较 染毒后1 d，染毒组血浆MDA含量急剧上升，以后各时段呈逐渐下降趋势，1，3，7，14，21 d明显高于对照组(P均<0.01)，28 d时仍高于对照组(P<0.05)，35 d时与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05)；同时段治疗组MDA含量较染毒组明显降低(P均<0.05)，但1，3，7 d明显高于对照组(P均<0.01)，14,21 d仍高于对照组(P均<0.05)，其他时段与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。染毒后1 d,染毒组血浆SOD活力即明显下降，以后各时段呈逐渐上升趋势，1,3,7 d明显低于对照组(P均<0.01)，14 d和21 d时仍低于对照组(P均<0.05)，其他时段与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；治疗组各时段SOD活力均较染毒组明显升高(P<0.01)，但1 d与3 d时明显低于对照组(P均<0.01)，7 d时仍低于对照组(P<0.05)，其他时段与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨 论

PQ属于有机杂环类、接触性、非选择性除草剂，易溶于水, 呈绿色、无味, 有腐蚀性，遇碱易分解，在酸性环境下较稳定，其有效成分为1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶二氯化物。在国内，PQ溶液的浓度一般为20%。若使用不当、误服及自杀性服用均可引起中毒，造成多器官损伤。目前多数学者认为，PQ分子作为电子受体经单电子传递被还原，然后再与氧分子(O2)反应，生成联吡啶阳离子和超氧阴离子(O2-)，PQ的还原氧化过程导致高活性氧自由基激增，而高活性氧可以引起脂质过氧化损伤,导致TNF-α表达异常以及炎性递质释放[2]。本研究发现，染毒初期大鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显增高，这说明它们参与了组织损伤的病理过程。

表1 3组血浆TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：①与对照组比较，P<0.01；②与染毒组比较，P<0.05；③与染毒组比较，P<0.05。

表2 3组血浆MDA含量及SOD活力比较

注：①与对照组比较,P<0.01;②与对照组比较，P<0.05；③与染毒组比较，P<0.05；④与染毒组比较，P<0.01。

TNF-α主要是由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，可促进炎性细胞聚集、浸润，使更多的细胞因子和炎性递质进一步分泌和表达，形成复杂的细胞因子网络。IL-1β主要由单核巨噬细胞产生，它可以刺激肝脏合成急性期反应蛋白，诱导IL-6的合成，上调炎性递质的表达，与TNF-α具有协同作用，促进炎性细胞聚集。IL-6是血管内皮细胞和单核细胞产生的炎症递质，作为对TNF-α、IL-1β、内毒素等刺激反应的第二信使，调控炎症反应及毒性作用。PQ中毒与细胞因子间不仅存在着密切的联系，而且细胞因子的产生似乎还有一定的先后顺序。本研究观察到，大鼠染毒1 d，血浆TNF-α水平首先升高，并在染毒3 d达到最高峰，随后逐步下降。继TNF-α之后，IL-1β分泌也迅速增加。IL-6产生较晚，但在血浆内持续时间较长。由此可见，PQ中毒早期释放的TNF-α可能是重要的启动因子，上调中毒时其他细胞因子的产生。已有报道，IL-6可下调单核细胞合成TNF-α、IL-1β。在PQ中毒晚期，血浆TNF-α、IL-1β水平下降，可能与IL-6的逐步释放增加有关[3]。本研究结果显示，PQ中毒过程中，细胞因子连锁反应的启动和放大表现为一种复杂、相互依赖的关系。这些细胞因子可以相互诱生，协同作用，从而在PQ中毒过程中形成一个复杂的细胞因子网络，这对PQ中毒的进展和严重程度有重要影响。

正常生理条件下，机体内产生的氧自由基很少，且组织细胞内存在着抗氧化酶系来阻止自由基的损伤，SOD是重要的抗氧化酶，它作用的底物是超氧阴离子自由基[4]。超氧阴离子自由基是所有氧自由基中第一个自由基，因此对它的清除十分重要。MDA是脂质过氧化物(LPO)终末代谢产物[5]，因此，测定MDA即可反映组织细胞内脂质过氧化程度，间接地反映出器官损伤的程度。MDA的测定经常与SOD的测定相互结合。MDA含量的高低间接反映了自由基损伤组织器官的严重程度，而SOD活力的高低又间接反映了机体清除氧自由基的能力。本实验结果显示，大鼠染毒1 d，血浆中MDA含量达到高峰，随后逐渐下降，而SOD活力达最低点，随后逐渐回升，提示染毒大鼠体内自由基明显增多，机体处于氧化应激状态，脂质过氧化反应增强，从而诱发组织损伤。

乌司他丁是143个氨基酸组成的糖蛋白，是典型的Kuniz型广谱蛋白酶抑制剂[6]。乌司他丁更重要的作用是能够抑制氧自由基的产生,阻止多种炎症递质的产生和释放，从而阻断细胞因子触发炎症递质的瀑布样级联反应[7]。本实验结果表明，乌司他丁明显抑制了PQ染毒大鼠血浆中MDA的升高，同时也提高了血浆中SOD的活性，其机制可能与其清除氧自由基、提高机体抗氧化酶的活力、改变抗氧化酶的基因表达有关。本研究也显示乌司他丁能减轻PQ染毒大鼠血浆中炎性细胞因子的水平可能是其保护组织结构与功能的机制之一。结合本研究结果及晚近有关文献资料，笔者推测乌司他丁可能通过阻断PQ诱导产生的氧自由基与细胞因子间的恶性循环，抑制蛋白酶活性和氧自由基的释放，进而减轻组织细胞的损伤,这还有待于进一步的研究探讨。

[1] 中国医师协会急诊医师分会.急性百草枯中毒诊治专家共识(2013)[J].中国急救医学,2013,33(6):484-489

[2] 刘思管，孔凡俊，程文伟. 百草枯中毒的机制与临床治疗进展[J]. 中医临床研究,2014,6(32):140-142

[3] 王恒石，胡喜梅，周水阳，等. 血清TNF-α、IFN-γ、IL-6水平与慢性病贫血的关系[J]. 山东医药,2014,54(45):79-81

[4] 祁俊，胡克苏，张逸，等. 胰岛素对脓毒症患者血清Wnt5a及SOD活性的影响[J]. 江苏医药,2104,40(24):2992-2994

[5] 张志刚，李一帆，朱丹，等. 人参对脊髓损伤大鼠MDA、SOD、NO含量的影响及意义[J]. 中风与神经疾病杂志,2014,31(12):1097-1099

[6] 贺艳阳，崔丙周，王博，等. 脑内血肿清除术后伴发多器官功能障碍综合征应用血必净和乌司他丁联合治疗效果分析[J]. 中药材,2014,37(6):1099-1101

[7] 姬伟凤，孙力勇. 乌司他丁治疗创伤性休克的研究[J]. 中华实验外科杂志,2014,31(11):77-79

Effects of ulinastatin on plasma inflammatory cytokines, MDA and SOD of rats with acute paraquat poisoning

WANG Xin, LI Bing, SUN Guiqin, LI Aijun, CHEN Ning

(Handan Central Hospital, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to evaluate the effects of ulinastatin(UTI) on the levels of inflammatory cytokines like TNF-α, IL-1β, IL-6, the content of MDA and activity of SOD in the plasma of acute paraquat-induced rats so as to investigate the mechanism of the paraquat injuring tissue. Methods One hundred and twenty-six healthy adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups: control group, poisoned group, treatment group. The poisoned group and treatment group was poisoned with 25 mg/kg paraquat by intraperitoneal injection, then the treatment group was given ulinastatin 3×104μg/kg by intraperitoneal injection once a day, and the control group and poisoned group was given the same volume of normal saline. On 1st, 3rd,7th, 14th, 21st, 28th and 35th day，six rats in each group were used to assess the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, the content of MDA and activity of SOD in the plasma. Results Compared with control group, the levels of TNF-α in poisoned group were significantly higher on the 1st day-21st day (P<0.01), the levels of IL-1β on the 3rd day-35th day (P<0.01), the levels of IL-6 on the 7th day-35th day (P<0.01) were also higher; Whereas the increases of these inflammatory cytokines were markedly inhibited in treatment group, in which the levels in some periods were still higher than that of control group. The levels of plasma MDA in poisoned group increased much after poisoning and gradually decreased at the next time stage, but they were significantly higher than that in control group on the 1st day-21st day (P<0.01); However the increases of MDA were markedly inhibited in treatment group, in which the levels were lower than that in the poisoned group at the same time stage but still higher than that in the control group on the 1st day-21st day (P<0.01). The activity of plasma SOD in poisoned group decreased much after poisoning and gradually increased at the next time stage, but they were significantly lower than that in control group on the 1st day-7th day (P<0.01), 14th day-21st day (P<0.05); However the activity in treatment group were higher than that in poisoned group at every time stage (P<0.01), but still lower than that in the control group on the 1st day-the 3rd (P<0.01) and on 7th day (P<0.05). Conclusion The levels of inflammatory cytokines like TNF-α, IL-1β, IL-6, MDA and the activity of SOD in plasma of acute paraquat-induced rats were changed. They could participate in the mechanism leading to tissue damage. The indexes were improved by ulinastatin, which might be closely related with its antioxidant effect and inhibition of inflammatory cytokines releasing.

paraquat; poisoning; inflammatory cytokines; ulinastatin

王鑫，男，硕士，主治医师，研究方向为急诊医学。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.006

R

A

1008-8849(2015)23-2527-04

2015-01-09