间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

吴小翠,王晓樱,魏剑浩,刘海灿,赵秀芹,夏远志,楼永良,吕建新,万康林,4

间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

吴小翠1,2,王晓樱3,魏剑浩1,2,刘海灿2,4,赵秀芹2,4,夏远志1,2,楼永良1,吕建新1,万康林1,2,4

目的 初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法 选取结核分枝杆菌临床分离株，5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液，平板接种37 ℃培养，选取生长良好的单个菌落培养增菌，提取基因组DNA，Spoligotyping进行基因分型鉴定，比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果 共选取32株结核分枝杆菌临床分离株，获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致，2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型，多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速，有效地区分结核分枝杆菌多重感染。

结核分枝杆菌；间隔区寡核苷酸分型；多重感染

近年来，随着对结核病感染传播机制研究的深入，人们对结核分枝杆菌的多重感染有了更多的认识。结核病的多重感染是指在结核分枝杆菌病人体内同时或先后感染2种或2种以上的不同基因型的结核分枝杆菌或不同种的分枝杆菌[1]。有关结核分枝杆菌多重感染的报道也越来越多。Dorío等人采用限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)在2岁的原发性感染的儿童体内分离出多种结核分枝杆菌[2]。Richardson等人采用IS6110-RFLP技术发现在高发病率地区，2.3%的病人存在结核分枝杆菌多重感染[3]。Chaves等人采用IS6110-RFLP技术发现在HIV合并结核感染的患者中存在结核分枝杆菌多重感染[4]。多重感染的研究对结核病的感染传播机制、治疗、疫苗、分子流行病学研究等方面有重要的意义。

IS6110-RFLP是一种以IS6610为基础的结核分枝杆菌分型的标准方法，但是该方法操作复杂，重复性差，实验结果不易进行实验室间比较[5]。近10年，以PCR为基础的Spoligotyping因其经济，快速，简便，易于标准化，被广泛应用于结核分枝杆菌的分型鉴定。Spoligotyping是基于结核分枝杆菌直接重复区(DR)的多态性而建立的一种方法[6]。它通过PCR扩增DR区，将标记的扩增产物与固定在Biodyne C膜上的寡核苷酸探针进行杂交，通过杂交信号的检测得到特异性的结果。

本研究采用Spoligotyping技术对32株内蒙的结核分枝杆菌临床分离株的306个单克隆标本进行基因分型，旨在证实我国结核分枝杆菌多重感染的存在，探讨Spoligotyping在结核分枝杆菌多重感染研究中的应用。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 32株结核分枝杆菌临床分离株随机挑选于内蒙古自治区结核病防治所[7]从内蒙地区2011年结核病患者分离获得菌株，由中国疾病预防控制中心传染病所结核室扩大培养及保存。标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室提供。

1.2 单克隆标本的分离 将32株结核分枝杆菌保存的菌株接种于Löwenstein-Jensen(L-J)固体培养基，挑取对数生长期的细菌，刮取L-J培养基上大部分培养物，采用TE缓冲液稀释、研磨，5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液，L-J固体培养基平板接种培养，4周后，每株菌中随机挑取10个生长良好的单克隆菌落，其中有5株临床分离株的单克隆菌落数不足10个，故单克隆标本数少于10个；32株结核分枝杆菌共分离306个单克隆菌落，置于500 μL生理盐水中形成菌悬液。再将单菌落悬液重新接种于L-J固体培养基上培养4至6周后，收集全部菌落于100 μL TE缓冲液中，沸水浴15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清置于-20 ℃保存。

1.3 间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping) 采用Spoligotyping分型技术对32株结核分枝杆菌临床分离株及其单克隆标本进行基因分型。Spoligotyping的操作按照Kamerbeek等人建立的Spoligotyping的标准化程序进行[6]。具体方法为：①PCR扩增：PCR扩增整个DR区。引物DRa：CGTTTTGGGTCTGACGAC,5′端生物素标记；DRb:CCGAGAGGGGACGGAAAC。PCR扩增条件为：96 ℃ 3 min后；96 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。②固定有间隔区寡核苷酸探针的Biodyne C膜的制备：Biodyne C膜具有Van Embden等[8]推荐的43个共价结合的寡核苷酸探针，每个寡核苷酸对应DR区位点间一个唯一的间隔区序列。其中37个间隔区序列来源于H37Rv标准株的DR区序列，其余的来源于M.bovisBCG的DR区序列。 先用新鲜配置的16% EDAC孵育膜15 min使膜活化，再用蒸馏水洗净。在Miniblotter凹槽中平行加入150 μL用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀释的0.125 μm寡核苷酸溶液，室温孵育1 min后，依次吸出寡核苷酸溶液，取出膜，用0.1 mol/L NaOH孵育10 min。将膜用2×SSPE/0.1%SDS于50 ℃洗膜10 min，再用20 mmol/L EDTA室温洗膜15 min,密封于塑料袋中置于4 ℃保存备用。③PCR产物的杂交与检测：用2×SSPE/0.1% SDS于50 ℃洗膜5 min，将膜置于Miniblotter中，方向与制备杂交膜垂直。用150 μL 2×SSPE/0.1% SDS稀释20 μL PCR产物，100 ℃变性10 min。将150 μL稀释的PCR产物加到凹槽中，50 ℃杂交60 min。取出膜，用2×SSPE/0.5% SDS在55 ℃洗膜2次，每次10 min。用2.5 μL辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素加到10 mL 2×SSPE/0.5% SDS中，42 ℃孵育膜30 min。洗膜后将杂交的DNA用地高辛/生物素杂交检测试剂盒检测，X光片曝光5 min。膜清洗后可反复使用。

1.4 数据分析 对Spoligotyping的43个间隔区杂交结果指纹图谱进行分析，结果以二进制表示，录入EXCEL，与数据库SpolDB4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/index.jsp)比对分析，从而确定基因型。并将来源于同一个临床分离株的单克隆标本结果进行比对，如有不同，则为多重感染菌株。用BioNumerics (Version 5.0)软件对确定为结核分枝杆菌多重感染株的单克隆标本进行聚类分析。

1.5 质控 将H37Rv和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照，每个临床分离株的单克隆标本均在同一时间完成Spoligotyping检测，如果为多重感染菌株，重复试验，检测是否为实验室污染造成。

2 结 果

2.1 临床分离株Spoligotyping结果 32株结核分枝杆菌临床分离株Spoligotyping指纹图谱，表现出7种基因型(表1)。其中27株均为北京家族株，包括26株典型的北京家族株(35～43之间的9个间隔区均为阳性)和1株非典型北京家族株(35～43之间的9个间隔区至少有3个为阳性)，剩余的5株均为独特基因型，分别为T2家族，T1家族，MANU2家族和两种新的Spoligotyping基因型，各1株(在SpolDB4.0数据库中无匹配结果)。

2.2 单克隆株Spoligotyping结果 实验编号为1到30的30株(93.75%)结核分枝杆菌临床分离株的单克隆株Spoligotyping指纹图谱与相应的临床分离株一致，实验编号为30和31的2株(6.25%)结核分离株临床分离株的单克隆株出现不止一种的Spoligotyping指纹图谱(表1)，为了验证实验结果的可靠性，重复实验，结果一致，排除了污染的可能，表明这2株临床分离株中存在不同基因型的菌株，确定为多重感染株。经BioNumerics聚类分析，其中1株临床分离株的10个单克隆标本，分为两种基因型(图1)，有9个单克隆标本表现为新的Spoligotyping基因型，与临床分离株结果一致，1个单克隆标本表现为北京家族株，分别为90%和10%(表1)；而另一株临床分离株中的10个单克隆标本可分为3种基因型(图2)，有3个单克隆标本与临床分离株结果一致，表现为MANU2家族，5个单克隆标本为北京家族，2个为新的Spoligotyping基因型，分别占30%、50%和20%(表1)。

3 讨 论

为了探讨Spoligotyping在结核分枝杆菌多重感染中的应用，本研究通过对32株结核临床分离株的单克隆标本进行Spoligotyping分型，证实在2株临床分离株中存在不止一种基因型，属于多重感染，说明Spoligotying可用于区分结核分枝杆菌多重感染。

结核分枝杆菌多重感染的研究使人们更加深刻地认识到结核分枝杆菌感染的复杂性。目前，仍然缺乏对结核分枝杆菌多重感染模式的研究。结核分枝杆菌多重感染可能是同时感染多种不用基因型的结核分枝杆菌，也有可能是初次感染一种结核分枝杆菌为潜伏性感染后，再次感染另一种结核分枝杆菌引起症状。多重感染发现提示机体感染一种结核分枝杆菌后可能对另一种结核分枝杆菌无法提供有效的免疫保护，这对于结核分枝杆菌疫苗的研究和开发有重要意义。有研究已证明，多重感染与同一病人结核分离株耐药表现发生改变有关[9]，这有助于制定有效的结核病的防控和治疗策略。

Note:※The clinicalM.tuberculosisisolate and corresponding had same spoligotype;

※※The spoligotype description binary of original clinical isolate which was proved to be multiple infections.

Spoligotyping技术已经被广泛应用于结核分枝杆菌的分型。本研究采用Spoligotyping技术对随机选取的32株结核分枝杆菌临床分离株的单克隆标本进行分型，有2株(6.25%)临床分离株出现了多种Spoligotyping指纹图谱，证明Spoligotyping可检测出结核分枝杆菌多重感染的存在。且Spoligotyping与IS6110-RFLP相比，经济、快速，操作简单，易于标准化，结果易读可靠，更易于推广。

结核分枝杆菌多重感染可能是广泛存在的现象，但关于结核分枝杆菌多重感染的研究仍然不足，缺乏深层次的认识。本研究建立了快速，有效的鉴定结核分枝杆菌多重感染的Spoligotyping技术，但仍存在一定的局限性。临床分离株的数目和单克隆标本数可能在一定程度上降低了多重感染的检出率。要掌握结核分枝杆菌多重感染的感染率，仍然需要更多的研究。同时，可与多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)技术联合应用于结核分枝杆菌多重感染的研究。

[1]Shamputa IC, Rigouts L, Eyongeta LA, et al. Genotypic and phenotypic heterogeneity amongMycobacteriumtuberculosisisolates from pulmonary tuberculosis patients[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(12): 5528-5536. DOI: 10.1128/JCM.42.12.5528-5536.2004

[2]Garcia de Viedma D, Marin M, Ruiz MJ, et al. Analysis of clonal composition ofMycobacteriumtuberculosisisolates in primary infections in children[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(8): 3415-3418. DOI: 10.1128/JCM.42.8.3415-3418.2004

[3]Richardson M, Carroll NM, Engelke E, et al. MultipleMycobacteriumtuberculosisstrains in early cultures from patients in a high-incidence community setting[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(8): 2750-2754. DOI: 10.1128/jcm.40.8.2750-2754.2002

[4]Chaves F, Dronda F, Alonso-Sanz M, et al. Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain ofMycobacteriumtuberculosisamong Spanish HIV-infected inmates[J]. AIDS, 1999, 13(5): 615-620.

[5]Kremer K, Van Soolingen D, Frothingham R, et al. Comparison of methods based on different molecular epidemiological markers for typing ofMycobacteriumtuberculosiscomplex strains: interlaboratory study of discriminatory power and reproducibility[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(8): 2607-2618.

[6]Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacteriumtuberculosisfor diagnosis and epidemiology[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(4): 907-914.

[7]Yu Q, Su Y, Lu B, et al. Genetic diversity ofMycobacteriumtuberculosisisolates from Inner Mongolia, China[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e57660. DOI: 10.1371/journal.pone.0057660

[8]van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, et al. Strain identification ofMycobacteriumtuberculosisby DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(2): 406-409.

[9]van RA, Victor TC, Richardson M, et al. Reinfection and mixed infection cause changingMycobacteriumtuberculosisdrug-resistance patterns[J]. Am J Respirat Critical Care Med, 2005, 172(5): 636-642. DOI: 10.1164/rccm.200503-449OC

《中国人兽共患病学报》已标注数字对象唯一标识符

数字对象唯一标识符(digital object identifier，DOI)是对包括互联网信息在内的数字信息进行标识的一种工具。它为数字信息提供了全球唯一的身份标识，就如同出版物贴上了条形码一样，无论走到哪里都有踪迹可寻。因而DOI被形象地称为数字资源的条形码或身份证。

为了实现《中国人兽共患病学报》内容资源的有效数字化传播，同时保护这些数字资源在网络链接中的知识产权和网络传播权，为标识对象的版权状态提供基础，实现对数字对象版权状态的持续追踪，自2012年第6期开始，本刊论文全部标注DOI。除了消息类稿件外，其他文章均标注DOI，DOI标注于每篇文章首页的左上角。

中国人兽共患病学报DOI标注如下：

DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.yyyy.nn.zzz

其各字段释义：“10.3969”为中文DOI注册机构分配给中国人兽共患病学报的统一前缀；“cjz”为中国人兽共患病学报(Chinese Journal of Zoonoses)缩写；“j”为journal缩写，代表信息资源类别为期刊；“issn.1002-2694”为国际标注连续出版物号(ISSN)；“yyyy”为4位出版年份；“nn”为2位期号；“zzz”为3位本期论文流水号。

《中国人兽共患病学报》编辑部

Multiple infections ofMycobacteriumtuberculosiswith spoligotyping

WU Xiao-cui1,2,WANG Xiao-ying3,WEI Jian-hao1,2,LIU Hai-can2,4,ZHAO Xiu-qin2,4,XIA Yuan-zhi1,2,LOU Yong-liang1,LU Jian-xin1,WAN Kang-lin1,2,4

(1.SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl/NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.DepartmentofPathophysiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForrensicMedicine,SichuanUniversity/CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China)

We assessed the application of spacer oligotyping (Spoligotyping) for identifying the multiple infections ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) preliminarily in this study. ClinicalM.tuberculosisisolates were randomly selected and prepared to single colony suspensions by filtration method with 5 μm pore diameter membranes. Then those single colony suspensions were inoculated on Löwenstein-Jensen slants at 37 ℃, from which the cultures of allM.tuberculosiscolonies were gathered and genomic DNA samples were extracted. The original clinical isolates and corresponding monoclonal strains were typed by means of Spoligotyping to compare the genotypes. Results showed that 32 clinicalM.tuberculosisisolates and 306 corresponding monoclonal strains were obtained. And the results of spoligotyping showed that 286 monoclonal strains had same spoligotypes as 30 original clinical isolates, but the monoclonal strains from two original clinical isolates showed diversity. The multiple infections rate ofM.tuberculosiswas 6.25%. It's suggested that spoligotyping can be used to distinguish multiple infections ofM.tuberculosisquickly and effectively.

Mycobacteriumtuberculosis; spacer oligotyping; multiple infections

Wan Kang-lin: Email: wankanglin@icdc.cn

国家科技重大专项课题(No.2013ZX10003002-001)资助

万康林，Email:wankanglin@icdc.cn

1.温州医科大学检验医学院生命科学学院，温州 325035； 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206； 3.四川大学华西基础医学与法医学院病理生理教研室，成都 610041； 4.感染性疾病诊治协同创新中心，杭州 310003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.001

R378.91

A

1002-2694(2015)01-0001-05

2014-09-14；

2014-11-03

Funded by the Research Project of the National Key Program of Mega Infectious Disease (No. 2013ZX10003002-001)