抗流行性乙型脑炎病毒药物的研究进展

蔡雨函,朱 玲,2,周远成,杨文宇,徐志文,2

抗流行性乙型脑炎病毒药物的研究进展

蔡雨函1,朱 玲1,2,周远成1,杨文宇1,徐志文1,2

流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis，JE)是由黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的，在自然界中主要以猪为宿主，经蚊传播的一种蚊媒性人兽共患传染病。该病主要流行于亚洲及西太平洋地区，严重威胁着人类健康，已成为人类脑炎疾病最主要的病因之一，并影响养猪业的发展，引起了世界性的广泛关注，因此，流行性乙型脑炎的防治研究有着重要的实际应用意义。到目前为止，尚无治疗流行性乙型脑炎特效药面市，但对抗流行性乙型脑炎病毒药物的研究已有一定的进展，而我国在这方面的系统介绍较少，本文就近10年来抗流行性乙型脑炎药物及其作用机制的研究进展做一综述，旨在为流行性乙型脑炎的预防和治疗提供参考。

流行性乙型脑炎；抗病毒；药物

流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis，JE) 简称乙脑，是由黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV) 引起的一种严重威胁人畜健康的急性中枢神经系统传染病[1]。该病主要分布于亚洲和西太平洋地区，以中国及东南亚地区流行最为严重。目前，JE已经扩散到西太平洋的一些岛屿，而我国除西藏、青海、新疆外，其他地区均有乙脑流行，约占世界60%的人口(近30亿)生活在JEV流行地区[2]。据WHO估计，每年全世界JE发病人数为3～5万人，其中造成1～1.5万人死亡，但仍有大量乙脑病例没有得到及时报道和列入统计数据，保守估计每年全世界 JE 发病人数达到7.5 万[3]。JE 也是养猪业最重要的繁殖障碍性疾病之一，可引起母猪流产、木乃伊胎、弱仔，公猪则表现为睾丸炎，给养猪业带来严重的经济损失[1]。因此，乙脑的防治研究有着重要的实际应用意义。

当前疫苗免疫预防仍是控制乙脑流行的主要措施，但疫苗本身具有一定的局限性，而且病毒的突变和种系的多样性以及考虑到病毒与宿主的紧密关联性等阻碍了疫苗的应用。此外，养殖业中以疫苗预防为主，不提倡JE 的治疗，但是对于已感染JE的人群，药物治疗才是根除乙脑病毒感染最有效的方法，因此，寻找具有预防和治疗作用的抗乙脑药物就显得尤为重要和紧迫。从过去到现在病毒学家一直都在寻找可以有效防治JEV的药物，虽然当前还未有治疗乙脑的特效药面市，但是许多研究已经有了一定进展。目前我国在抗乙脑病毒药物方面系统介绍的较少，本文就最近10年获得的具有抗乙脑效果的药物及其作用机制做一综述，并按照药物性质进行了简单的分类，旨在为进一步研究抗病毒途径，研发出特效的治疗药物提供新的思路和方向。

1 人工合成的抗病毒药

1.1 核酸靶向治疗剂

1.1.1反义寡核苷酸 反义寡核苷酸技术是利用碱基互补原理，与靶mRNA或靶DNA互补配对，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RnaseH识别并切割mRNA，使其丧失功能。因此，通过反义分子定向针对病毒基因组来阻止病毒复制不失为一种有效治疗JEV的方法。吗啉反义寡核苷酸是一种不带电的反义寡聚物，能抑制细胞内mRNA的剪接过程，从而抑制基因的表达；同时具有良好的稳定性、溶解度和细胞渗透性[4]。Anantpadma M 等[5]通过建立细胞模型及小鼠模型来评估肽共轭磷酸二胺吗啉低聚物(PPMOs)抗病毒活性。结果显示针对乙脑3′端环化序列(3′CSI)的PPMOs在Vero(上皮)、Neuro2A(神经元)及J774E(巨噬细胞)中具有显著的抗病毒活性。PPMOs的抗病毒效果在体内也被证实。1周龄小鼠脑内感染致死剂量的JEV后，连续5 d每12 h注射20 mg/kg的PPMOs，对小鼠有60%～80%的保护率，而且在用药第2 d在小鼠脑组织中已经检测不到JEV。Nazmi A等[6]也通过小鼠试验证明吗啉具有神经保护作用，有效增加了动物的存活率。结果表明，吗啉反义寡核苷酸具有显著抗乙脑活性。

1.1.2 酶制剂 脱氧核酶(DNAzymes,Dzs)是一类具有催化活性的单链DNA分子，兼具反义寡核苷酸的反义抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等双重优势，而且稳定性好。Appaiahgari M B等[7]针对JEV 3′-NCR合成Dz 3Dz，并在其3′端加上[poly-(G)10](3DzG)后证明具有显著的抑制病毒在细胞及鼠脑中增殖的能力。这也是第一次在体内试验中应用Dzs治疗病毒感染获得成功，为Dzs在病毒感染治疗中的应用带来了新的希望。

先前研究表明牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana ribonuclease，RC-RNase)具有抗肿瘤活性，Lee Y 等[8]报道其还具有抗乙脑活性，进一步研究发现它是通过活化caspase-3、caspase-8及caspase-9 活性诱导被感染JEV BHK-21细胞凋亡，从而抑制病毒增殖。

1.1.3 SiRNA/ShRNA RNA 干扰是一种由双链RNA介导的在转录后水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制，由Fire等于1998年在研究秀丽线虫基因组计划时首次阐明。目前已被广泛用于传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域，是一种有希望的抗病毒感染手段。许多研究已经报道siRNA或shRNA能在体内、体外抑制JEV 的复制[9-12]。目前JEV分有5个基因型，但之前研究的siRNA沉默机制主要是针对JEV 基因Ⅲ型发挥效应，由于5种基因型病毒基因之间存在较高的遗传变异，所以能抑制基因Ⅲ型的siRNA可能并不能抑制其它基因型病毒的复制。Wu Z 等[13]构建了一个单一的microRNA-like 的多顺反子，利用聚合酶Ⅱ启动子同时表达9个针对JEV 保守序列设计的siRNA，结果显示此多顺反子能显著降低所有基因型病毒含量。Kumar P等[14]报道针对JEV 和西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)共同保守的序列合成的siRNA能同时抑制这两种病毒感染小鼠。这个结果清楚的表明，在设计药物的靶位点时，一个单一的siRNA可以抑制多种病毒的混合感染，从而可以同时治疗有共同症状的急性病毒感染。

1.2 核酸类似物 利巴韦林(ribavirin)是于1972年合成的核苷类广谱抗病毒药。最近研究表明，该药的抗病毒机制除了抑制磷酸肌苷脱氢酶(IMPDH)和调节免疫外，它还可以通过RNA聚合酶结合于病毒基因组中，导致病毒基因组出现致命的基因突变，直接产生抗病毒效应[15]。许多体外[16-17]及动物实验[18]证明利巴韦林对虫媒病毒(包括JEV及WNV)的抗病毒效果是非常明显的。在某些南亚国家，已经有用利巴韦林治疗乙脑的经验[19-21]。不过，Kumar R等[21]报道当儿童感染JEV后，口服利巴韦林并不能降低早期致死率。口服高剂量的利巴韦林及利用其它给药途径治疗乙脑的效果还需要进一步研究。

1.3 细胞因子类 已有研究报道干扰素(interferon)的作用机制是通过作用于健康组织的细胞后产生抗病毒蛋白阻碍病毒复制，保护宿主不遭病毒破坏，从而抑制病毒播散，同时可调节免疫，增强T、B 细胞活性，促进细胞的吞噬作用。近年研究表明乙脑的发病机制为病毒对神经组织的直接侵袭作用和免疫损伤。因此, 用干扰素治疗乙脑在理论上是可行的。目前，许多体外、动物实验及临床实验已经证明干扰素确有抗乙脑活性[16,18,22-23]。Yang T 等[24]报道I型干扰素是针对NS5蛋白阻碍JEV 复制。

JEV感染宿主后会快速产生炎症反应，TNFa的增加会促进病毒的增值，逃避宿主防御，从而引起病人的预后不良[25-26]。因此，能抑制TNFa的复合物可能会减少JEV感染的严重程度。己酮可可碱(Pentoxifylline)是已知的抗肿瘤坏死因子，多项调查研究表明，己酮可可碱对一系列的RNA和DNA病毒具有广谱抗病毒活性。Sebastian L 等[27]通过体内及体外试验研究显示己酮可可碱以剂量依赖的方式抑制JEV在细胞中增殖，同时能保护小鼠免受致死性JEV的攻击。其作用机制有可能是对病毒的组装和/或释放产生作用。

1.4 黄酮类化合物 最近研究表明NS1’蛋白在乙脑病毒神经侵袭力方面发挥巨大的作用，而该蛋白是由位于NS1 C端，NS2基因下游的假结结构(pseudoknot structure)引发的α-1核糖体读码框位移而产生。这个假结结构的稳定性与核糖体移码效率有关[28-29]，小分子紧密结合这一序列会干扰该假结结构的稳定性，从而影响NS1’蛋白的形成，因此此位点可能是潜在的设计抗乙脑病毒药物的靶点。Zhang T 等[30]研究表明山奈酚和黄豆苷均能抑制乙脑病毒在BHK-21细胞中增值，进一步发现其作用机制即是通过与fsRNA(frameshift site RNA)结合从而使病毒失活。

1.5 抗生素类 米洛环素(Minocycline)是广谱抗生素-四环素成员，已报道其具有抗虫媒病毒活性。Mishra M等[31]进一步研究米洛环素在体外试验中抗乙脑病毒作用。结果显示，米洛环素能降低神经细胞凋亡，细胞感染JEV 9 d后，病毒滴度大幅度降低。米洛环素还具有抗氧化作用，能显著改善由乙脑感染引起的氧化应激[32]；同时也能保护血脑屏障，阻止JEV的扩散[33]。

1.6 其它 已有报道CSA(cyclosporin A)具有抗乙脑活性，Kambara H 等[34]研究表明CSA是通过抑制CypB与NS4A相互作用抑制病毒复制。内质网的葡萄糖苷酶抑制剂能够对一些内质网出芽病毒包括JEV发挥抗病毒效应[35]。Sehgal N 等[36]发现用过氧化物酶体增殖物激活受体α激动剂-非诺贝特(Fenofibrate)预处理小鼠4 d，能保护80%小鼠免受JEV致死性病毒的攻击，因此可以作为一种预防用药。

2 天然药物中获得的抗病毒药

天然产物特别是植物一直是新药先导化合物和新药发现的重要资源，目前大约有25%的新药源于植物，从中筛选有效成分也成为当前抗病毒新药研究的热点。

2.1 黄芪、连翘 洪文艳等[37-38]研究表明黄芩提取物及连翘浓缩煎剂在体外细胞模型中有一定的抗乙脑病毒感染作用，但对JEV无直接灭活作用，作用机理可能是通过干扰病毒对细胞的吸附及抑制病毒在细胞内的复制增殖，且作用效果与用药剂量呈正相关的剂量效应依赖性。

2.2 板蓝根提取物 Chang S等[39]通过体内及体外试验分别研究了板蓝根提取物(乙酸乙酯提取物和甲醇提取物)及其相关化学组成物(靛蓝、靛玉红、色胺酮、腺苷、白桦脂醇、羽扇豆醇及2-苯并恶醇)对乙脑的抑制作用。结果显示板蓝根提取物中有潜在的抗乙脑病毒作用的成分，其中，靛玉红表现出更高的抗病毒活性，其作用机制可能是干扰病毒对细胞的吸附。

2.3 藻类提取物 近年研究表明硫酸多糖无论在体外还是体内，都显示了不同程度的抗病毒活性，尤其是与目前使用的其他抗病毒药物相比，因其细胞毒作用较小而得到广泛的关注。已有研究报道硫酸多糖具有抗乙脑活性。Chiu Y等[40]发现从石莼中提取的硫酸多糖(sulfated polysaccharide)能抑制JEV感染Vero细胞。在动物试验中，JEV感染 C3H/HeN小鼠后在第15 d会出现神经行为的异常情况，于第17 d死亡。但是在感染JEV前用从石莼提取的硫酸多糖预处理能延迟发生的时间，因此能阻止小鼠死亡。其作用机制是通过阻止病毒吸附而发挥作用。Kazowski B等[41]报告从江蓠属和海菜中提取的新的低程度聚合的硫酸糖(low-degree-polymerisation sulfated saccharides)比未消化的多糖(PS)抗病毒能力更强，其原因可能与低DP硫酸糖比PS更好吸收有关。

2.4 喜炎平注射液 喜炎平注射液是由穿心莲总内酯(穿心莲甲素、乙素、丙素、丁素)、穿心莲新苷、脱水穿心莲内酯等成分组成，经过磺化工艺处理，提高了有效成分穿心莲内酯的纯度，可减少临床使用中药注射剂的毒副作用。其对多种病毒有灭活作用，还具有抗病毒、抗菌、抗炎解热，增强免疫，增加肾上腺皮质功能等作用。涂晋文等[42]通过临床观察结果表明，喜炎平注射液治疗能明显缩短体温下降时间和病程时间，改善昏迷和抽搐等症状。而且在治愈率和好转率上都大于西药对照组。喜炎平注射液因其安全有效，副作用少，有望成为新一代治疗乙脑的药物。

2.5 牛蒡子甙元 牛蒡子甙元(Arctigenin)具有抗氧化，抗炎，抗病毒作用。据报道，用牛蒡子甙元治疗感染JEV的小鼠效果显著，能明显降低病毒诱导的神经元凋亡、小胶质细胞的活化及活化的半胱天冬酶活性。报道还称牛蒡子甙元能直接作用于大脑细胞，这样更利于治疗乙脑[43]。

2.6 酚类化合物 迷迭香素(rosmarinic acid)是发现于唇形科草本植物中的一种酚类化合物，具有抗炎及抗氧化功能。Swarup V等[44]报道在建立的小鼠模型中，迷迭香素能抑制JEV的复制，而且能改善由小胶质细胞引发的继发反应。姜黄素(Curcumin)是从姜黄中提取的酚类化合物，已被证明在体外感染JEV研究中具有抗病毒效应，它可能通过降低细胞内活性氧水平，减少促凋亡信号分子，恢复细胞膜完整性，调节相关应激蛋白来发挥作用[45]。

3 展 望

目前临床上针对感染乙脑的人群，还是以积极的对症治疗和细致的临床护理为主，特别是对于重症乙脑患者，高热、抽搐、呼吸衰竭这三关的护理是降低病死率和减少后遗症的关键。但是综合的治疗方法并不能有效治愈患者，目前全世界由乙脑引起的死亡率还是很高，通过特效药治疗加上适当的临床护理才是治疗乙脑最有效的办法。近年来有关抗乙脑药物的研发是国际上生物学、医学领域研究的热点，经过病毒学家的不懈努力，已经发现多种药物具有抗乙脑活性，但是这些药物作用效果评估主要停留在动物模型、细胞和分子水平上，临床用药的效果评价较少，因此，还需要进一步进行疗效及相关药理学研究，确证该药物能够治疗感染乙脑的人群及动物，能够将其投入到临床应用中。

总结以上抗乙脑药物的作用机制显示，其研究策略主要有以下3点：抑制病毒蛋白或基因功能、增强机体抗病毒免疫功能及作用于宿主细胞中参与病毒生命周期的“帮凶”分子。在临床上，利用不同药物的抗病毒机制及药物间协同作用，将不同药物联合使用能够提高药物的治疗效果，更有效地抑制病毒复制，降低药物使用剂量，降低毒性和可能出现的药物抗性。因此，联合用药将是乙脑临床治疗的发展方向。我国的植物资源极为丰富，具有应用植物药进行疾病防治的悠久传统。目前已经发现许多从植物中提取的产物具有抗乙脑的作用，应该进一步重视从植物源中寻找新的抗JEV药物或先导化合物的开发研究。RNAi是近几年新兴起的研究热点，由于其特异性高，安全性好，在抗病毒研究领域具有良好的应用前景，如果在理论和技术上加以完善，siRNA可能成为抗乙脑病毒特效药物。MicroRNA( MiRNA)是 21 世纪生命科学研究的重大发现，其作用机制与siRNA相似，已有大量研究证明MiRNA可以对病毒起到调节作用，故可以发展成为一种新型的抗病毒药物，而目前关于乙脑MiRNA的研究国内外还是空白，因此这也是今后抗乙脑药物研究的一个方向。随着生物工程和制药技术的飞速发展，乙脑的治疗一定有很好的前景，安全、高效的抗JEV药物将很快投入到临床应用。

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1986年，我在山东师范大学教育系读研究生时，就系统地研究了捷克教育家乔治·洛扎诺夫（Georgi Lozanov）的暗示教学法及苏联教育家沙塔洛夫的纲要信号图示教学法。1990年下半年，我与山东省邹平县教研室和淄博市临淄区教研室合作，首先在初中生物、历史、地理、数学教学中推广纲要信号图示教学法，在中小学的语文、英语、数学教学中推广暗示教学法，简称“两种愉快教学法实验”。

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Research advances in antiviral drugs for Japanese encephalitis

CAI Yu-han1,ZHU Ling1,2,ZHOU Yuan-chen1,YANG Wen-yu1,XU Zhi-wen1,2

(1.AnimalBiotechnologyCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China;2.KeyLaboratoryofAnimalDiseasesandHumanHealthofSichuanProvince,Ya’an625014,China)

Japanese encephalitis (JE), an insect-borne zoonotic infectious disease, is caused by Japanese Encephalitis Virus (JEV) that belongs to the genusFlaviviruswithin the familyFlaviviridae, and the most important hosts of which in nature is pigs. This disease occurs mainly in Asia and the Western Pacific region, and has become one of the most serious encephalitis diseases which threats to human and affects the development of pig farming industry. It causes great attention in global scale, therefore, it is of great actual significance to study the prevention and control of JE. So far, there is no specific antiviral drug available to treat JE, however, research in antiviral drugs for JE has some progress. The report on the antiviral drugs for JE is quite few in China. In this paper, we briefly review advances on the antiviral drugs for JE and its mechanism in the past 10 years, aiming at serving as a guide for prevention and control of this disease.

Japanese encephalitis; antiviral; drugs

Xu Zhi-wen, Email:abtcxzw@126.com

徐志文，Email: abtcxzw@126.com

1.四川农业大学 动物生物技术中心，雅安 625014； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，雅安 625014

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.017

R978.7

A

1002-2694(2015)01-0077-06

2014-02-19；

2014-10-05

四川农业大学优秀硕士论文培育基金(YS2014006)；四川省科技支撑计划项目(2012NZ0001)

Supported by the Excellent Master Dissertation Fostering Foundation of Sichuan Agricultural University (No. YS2014006), and the Sichuan Provincial Science and Technology Support Program (No. 2012NZ0001)