以乙型肝炎核心病毒蛋白为载体融合金黄色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

白 靓，成 岩，刘 燕，张树军，曹瑞珍

以乙型肝炎核心病毒蛋白为载体融合金黄色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

白 靓1,2，成 岩3，刘 燕1,2，张树军1，曹瑞珍1

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，Saureus)，是一种最常见的条件致病菌。可以引起人和动物的多种类疾病，感染牛导致的牛乳房炎给奶牛产业造成巨大损失；感染人可引起皮肤和软组织感染，严重者可出现肺炎、菌血症、脓毒血症、心内膜炎及骨髓炎[1]。Saureus中存在大量的耐药株，尤其是耐甲氧西林Saureus，降低了抗生素疗法的可靠性[2]。疫苗可以通过主动免疫或被动免疫途径切断感染辅助抗生素疗法，但至今还没有商品化的Saureus疫苗上市，研发竞赛已在全世界范围展开[3]。

铁调节表面决定因子A(iron-regulated surface determinant A，IsdA)是Saureus表面蛋白中的一员，由350aa组成，功能是参与细菌对血红素中铁的摄取。IsdA的N-末端为铁转运蛋白结构域，与转铁蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、血红素、角质细胞的包膜蛋白等受体结合，帮助S.aureus的粘附及传播[4]。IsdA的C-末端结构域可增强S.aureus亲水性，能逃避人类皮肤分泌杀菌脂肪酸、抗菌肽的杀伤[5]。Stapleton等[6]报道IsdA215-310多肽高度保守，且使用这段表位多肽免疫小鼠后可诱导具有调理吞噬功能的保护性抗体，但产生抗体滴度较低。据此我们推断IsdA215-310含有抗原表位，为了进一步提高IsdA215-310的免疫原性，我们尝试使用乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)作为载体。HBc载体是将其(共183aa)N端144个aa装配成的类病毒颗粒，外源的表位可以通过基因工程方法插入到HBc载体的N端、C端或免疫显性区(MIR区，位于HBc76-82aa)，其中MIR区在提高外源表位免疫原性方面效果最佳[7]。Clarke等首次使用HBc作为表位载体并阐释其优点，他们选择口蹄疫病毒的主要抗原VP1蛋白作为研究对象，将VP1的表位放至HBc的N末端，结果显著提高了多肽的免疫原性[8]。

本研究我们用基因工程法将IsdA215-310多肽插入到HBc的MIR区，通过大肠杆菌表达制备出融合蛋白抗原，通过小鼠免疫试验评价其诱导抗体的水平，及对小鼠的免疫保护作用，为预防性S.aureus疫苗的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 基因、质粒与菌株 HBc(GenBank,No:429475205)，IsdA (GenBank,No:ap009351.1)；表达载体pET28b(+)、表达菌株BL21(Novagen)；大肠杆菌DH5α、Saureus(Newman株)由内蒙古民族大学生物化学与分子生物学实验室保藏。

1.2 主要试剂与实验动物 限制性核酸内切酶(NcoⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ)(宝生物)；DNA分子量标准D2000、MarkerⅢ，蛋白质分子量标准14.4～94.0 kDa(天根生物公司)；WB预染蛋白质分子量标准SM0671(Thermo)； HisTrap FF(GE Healthcare)； HRP标记的羊抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；rIsdA蛋白、rIsdA多克隆抗体(兔源，1∶12 800),内蒙古民族大学生物化学实验室制备保存；弗氏佐剂(sigma)；BALB/c小鼠，雌性，4～6周龄，购自吉林大学实验动物中心。

1.3 基因设计与合成 依据GenBank公布序列，设计目的基因HBc-IsdA215-310，结构示意图(图1)。IsdA215-31095aa插入替换HBc(144aa)的第76～82位aa，共232aa，696 bp。基因上游引入NcoⅠ序列，下游引入XhoⅠ序列。序列由上海生工公司合成，质粒命名pUC57-HBc-IsdA215-310。

1.4 pET28-HBc-IsdA215-310载体构建与表达 对提取质粒pUC57-HBc-IsdA215-310、pET28b(+)双酶切(NcoⅠ，XhoⅠ)。使用凝胶回收试剂盒制备载体与目的基因，并对回收产物连接、转化，通过酶切、测序鉴定阳性克隆。提取阳性质粒pET28-HBc-IsdA215-310转化入BL21感受态，筛选阳性克隆菌37 ℃培养，菌体OD600为0.5时用IPTG诱导，6～8 h后离心收集菌体，超声破碎，离心收集沉淀与上清，12% SDS-PAGE。

1.5 Western blot及纯化 HBc-IsdA215-310蛋白经12%SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，一抗选择兔源rIsdA多克隆抗体(稀释度1∶1 000)孵育过夜，洗涤后加入HRP标记羊抗兔IgG作为二抗(稀释度1∶1 000)，DAB显色，水洗膜终止反应，记录结果。纯化蛋白首先超声破碎菌体，经鉴定蛋白存在上清中，收集超声裂解液上清用0.45 μm滤膜过滤后，过HisTrap FF镍柱，洗脱缓冲液梯度洗脱，收集样品12% SDS-PAGE。

1.6 小鼠分组及免疫 BALB/c小鼠分为4组，每组10只，分别为HBc-IsdA215-310、HBc-IsdA215-310添加佐剂、rIsdA添加佐剂，对照组(PBS)。免疫方法采用小鼠腿部肌肉注射，免疫接种共2次，分别于0 d、11 d，剂量100 μg/只。蛋白抗原去内毒素后，第1次免疫接种使用等体积弗氏完全佐剂，第2次用弗式不完全佐剂。免疫动物的采血时间为11 d、20 d，每次随机选取5只小鼠尾静脉取血，进行IgG抗体效价检测。

1.7 抗体ELISA检测及小鼠攻毒试验 间接ELISA法检测血清IgG，分别取rIsdA、HBc-IsdA215-310抗原(1 mg/mL)4 ℃过夜包被ELISA板，次日置于含有BSA的封闭液中封闭反应1 h。取实验组鼠血清按1∶100倍稀释的初始浓度加入到ELISA板内，按倍比稀释法稀释，37 ℃孵育1 h，洗涤液冲洗5遍后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育反应1 h，洗涤及TMB显色，用酶标仪在492 nm测定各孔吸光值，样品OD值≥2.1阴性对照OD值，判定为阳性，并记录最终效价值；攻毒试验：取30 μL冻存的菌液接种到TSB培养基上复壮，按平板计数法测定培养基细菌数。取初次免疫后21 d小鼠(10只)，腹腔内接种2×1010CFU/只(LD50)[9]，连续观察7 d，记录小鼠死亡情况。

2 结 果

2.1 重组质粒载体酶切鉴定结果 pET28-HBc-IsdA215-310质粒采用XhoⅠ与XbaⅠ双酶切后，经过琼脂糖凝胶电泳，获得片段约为730 bp和5 200 bp(图2)，结果与预期一致。

2.2 重组蛋白表达、纯化结果 HBc-IsdA215-310表达菌诱导前、诱导后、纯化及rIsdA对照的SDS-PAGE电泳，结果在26 kDa、38 kDa左右出现目的条带，结果与预期一致(图3)。

M: DNA markerⅢ; 1: pET28-HBc-IsdA215-310; 2: Digested byXhoⅠandXbaⅠ.

图2 pET28-HBc-IsdA215-310的酶切鉴定

Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids pET28-HBc-IsdA215-310

M: Protein molecular weight marker; 1: Unintruduced bacteria expressing HBc- IsdA215-310; 2: Intruduced bacteria expressing HBc-IsdA215-310; 3: Purified HBc- IsdA215-310; 4: Purified rIsdA.

图3 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE

Fig.3 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 by SDS-PAGE

2.3 重组蛋白的Western blotting 分析 取rIsdA多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗，对重组蛋白HBc- IsdA215-310及 rIsdA进行Western blotting检测，结果显示在26 kDa和38 kDa附近位置出现特异性条带，与预期一致(图4)。

M: Protein molecular weight marker; 1: HBc- IsdA215-310; 2: rIsdA..

图4 重组蛋白的western blot 分析

Fig.4 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 and rIsdA by western blot

2.4 重组蛋白HBc- IsdA215-310在小鼠体内诱导特异性抗体的检测 间接ELISA法检测血清特异性IgG。使用rIsdA作为包被抗原在20 d检测IgG效价, rIsdA添加佐剂组与HBc-IsdA215-310添加佐剂组相比较(P=0.004,P<0.01)(表1)；使用HBc-IsdA215-310作为包被抗原在20 d检测IgG效价，HBc-IsdA215-310添加佐剂组与rIsdA添加佐剂组相比较(P=0.002,P<0.01)(表2)。免疫组能诱导小鼠出现高特异性IgG抗体。

表1 rIsdA作为包被抗原检测免疫血清特异性抗体效价值

Note: *P<0.01 compared with HBc-IsdA215-310+adjuvant.

表2 HBc-IsdA215-310作为包被抗原检测血清特异性抗体效价值

Note:*P<0.01 compared with rIsdA+adjuvant.

2.5 攻毒实验结果 免疫组和对照组在初次免疫后21 d开始攻毒实验，观察7 d。结果显示，HBc-IsdA215-310添加佐剂组保护率70%(P=0.370)，HBc-IsdA215-310保护率60%(P=0.656)，rIsdA保护率50% (P=1.000)，PBS对照组保护率40%。各免疫组与PBS对照组相比(P>0.05)，免疫组与对照组免疫保护率差异无统计学意义(图5)。

Fig.5 Efficacy of immunization with antigens against LD50S.aureuschallengein mice

3 讨 论

随着Saureus的耐药株比例不断攀升及抗生素的滥用，给Saureus感染的治疗带来巨大困难。通过疫苗接种预防Saureus感染是一种理想的治疗方案。根据Saureus构建的灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、特异性单克隆抗体在临床实验中均以失败告终[10]，这一结果对疫苗抗原的选择提出了更苛刻的要求。

为了设计新型Saureus疫苗，我们选择应用HBc为载体蛋白携带Saureus抗原表位，以此提高抗原的免疫原性。HBc本身具有Th表位，可以帮助产生针对外源表位的抗体；HBc与外源表位能共同组装成直径为36 nm大小的类病毒颗粒，有利于抗原的加工呈递[11]；HBc还具有T细胞非依赖抗原的特征，可以直接激活B淋巴细胞产生抗体，并拥有强大的诱导针对外源表位的B、Th、CTL细胞应答的能力[12]。HBc载体的插入位置选择灵活，可以选择N末端，C末端及MIR区(76-82aa)，通过对HBc空间结构分析发现MIR区在诱导抗HBc抗体方面占绝对主导，将该区域替换成外源表位，可诱导出抗该表位的特异性抗体[13]。本研究选择使用MIR区作为插入位点，利用已知的基因序列信息，通过全基因合成法直接合成出嵌合蛋白的基因，减少了抗原从设计到制备的时间。除了对插入位点的选择外，对于外源插入表位多肽片段的长度也要加以限制，表位长度最小可以是5～15aa的B细胞表位，片段最大载量为258aa的绿色荧光蛋白片段，超出这一范围会影响HBc的空间结构，降低免疫原性[14]。本研究使用95aa的IsdA215-310片段，对HBc的空间正确折叠影响有限。对于插入抗原的选择，应选择分子量大小适中，免疫原性强，高度保守性的蛋白，而IsdA符合上述条件。Stranger等[9]及Schneewind等[15]利用IsdA的抗原特征进行疫苗研究，取得理想的效果，而我们选取的IsdA215-310已被证实能诱导具有调理吞噬功能的抗体[6]。

本研究使用HBc作为载体与IsdA215-310在大肠杆菌中嵌合表达，通过Western blot分析及小鼠免疫试验分析所表达蛋白的免疫活性，结果表明嵌合基因能够在大肠杆菌系统中正确表达，而且表达蛋白经过分离纯化可以在小鼠体内诱导出特异性的IgG抗体(效价值：20480±7010)，对完成免疫程序后的小鼠使用Newman株LD50攻毒，免疫保护率达70%，虽然比rIsdA免疫保护率(50%)高出了20%，但经Fisher精确检验确定(P>0.05)两者差异不显著；各免疫组与PBS对照组相比(P>0.05)差异不显著。HBc-IsdA215-310免疫组对小鼠免疫保护率最高，这可能与HBc特有的结构优势促进外源抗原表位在体内的加工与呈递有关，而IsdA215-310中存在表位的种类与结构需要进一步的表位作图来证实。攻毒试验结果虽然没有达到100%保护，但给我们提供了一个思路，下一步可以从Saureus表面蛋白中选取其抗原表位进行与此相似的实验，制备出多亚单位联合疫苗，提高免疫保护率。除此之外，本实验所涉及到的攻毒菌株种类(Newman株)，使用的疫苗佐剂类型(弗氏佐剂)及实验动物种类(BALB/c)的选择都会对HBc-IsdA215-310抗原的免疫保护效果产生影响，进一步实验还可尝试使用不同毒力的Saureus进行攻毒保护实验；使用不同佐剂优化免疫效果；更换其它种类的实验动物进行免疫试验。本研究为新型Saureus疫苗研究提供参考。

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美国《Emerging Infectious Diseases》2014年第11期有关人兽共患病论文摘译

P1803 1918年智利流感大流行期间的死亡模式\ Gerardo Chowell，Lone Simonsen，Jose Flores，等

南美洲历史性流感大流行流行病学信息的缺乏妨碍了对整个美洲大陆及不同气候区域流行模式的完整理解。为填补1918年智利流感大流行相关的死亡时空模式的空白，我们对档案记录进行了回顾。我们发现的证据表明，同年不同时期有多流行波出现，1918-1921年间出现流行强度的波动，流感相关的超额死亡高峰出现在1919年7-8月。所有年龄组包括50岁以上成人，与大流行相关的死亡率均升高，年轻的成年人与基线相比升高最多。总之，估计智利流感大流行引起的超额死亡率为0.94%，与其他拉丁美洲国家的报告率相似，而各省率值波动相差约10倍。 大流行期间的死亡模式受宿主特异的敏感性，人口密度，基线死亡率和气候变化的影响。

P1812 超毒力和耐多药肺炎克雷伯菌克隆组群的基因组定义\ Suzanne Bialek-Davenet，Alexis Criscuolo，Florent Ailloud，等

耐多药和高毒力的肺炎克雷伯菌菌株不断涌现，但是对应于这些高危毒株的克隆组群(CGs)仍不能精确定义。我们的目标是在全基因组变异的基础上对肺炎克雷伯菌克隆组群进行鉴定，并提供一个简单的生物信息工具，从基因组数据中提取毒力及耐药基因数据。我们对48株绝大多数菌株血清型为K1和K2的肺炎克雷伯菌进行了测序，并将其与119个可公开获取的基因组进行了比较。共有694个高度保守的基因纳入了核心基因组多位点序列分型计划中，数据聚类分析使超毒力和多耐药克隆组群全球分布情况的精确定义得以实现。此外，我们创建了BIGSdb-Kp，在这个自由开放的数据库中能够从肺炎克雷伯菌基因组序列快速提取相关的医学和流行病学信息。虽然肺炎克雷伯菌耐药和毒力种群很大程度上不重叠，仍检出了兼有两者特征的菌株。

P1821 2013年麦加朝圣期间朝圣者中的呼吸道病毒和细菌\ Samir Benkouiten，Rémi Charrel，Khadidja Belhouchat，等

从麦加朝圣返回的朝圣者可能导致呼吸道病原体的国际传播。2013年，对129个朝圣者离开法国前及离开沙特阿拉伯前的鼻和咽拭子标本进行了呼吸道病毒和细菌的PCR检测。总体而言，分别有21.5%和38.8%的朝圣前和朝圣后的标本，发现一个以上病毒阳性(P=0.003)。在沙特阿拉伯期间，29.8%的参与者获得了一个以上的病毒，尤其是鼻病毒 (14.0%)，冠状病毒 E229 (12.4%)及H3N2甲型流感病毒 (6.2%)，无一例参与者发现中东呼吸综合征冠状病毒阳性。此外，分别有50.0% 和 62.0%朝圣前和朝圣后的标本肺炎链球菌阳性 (P=0.053)。36.3%的参与者在逗留期间获得了肺炎链球菌。我们的研究结果证实了在朝圣者中鼻病毒和肺炎链球菌的高采集率，也强调了对冠状病毒E229的采集。

P1828 2010-2011年意大利人基因IV型诺如病毒抗体血清阳性率\ Barbara Di Martino，Federica Di Profio，Chiara Ceci，等

基因IV型(GIV) (α粒子样)诺如病毒 (NoVs)导致人及肉食性动物，如狗和猫的感染。我们在意大利筛查了535份按年龄分层收集的人血清标本，使用在人传播的GIV.1基因型和在动物中确定的GIV.2基因型的病毒样颗粒，通过ELISA法来调查GIV NoV特异性IgG抗体的流行率。对两个基因型特异抗体均进行了检测，不同年龄组中GIV.1流行率范围为6.6%～44.8%，GIV.2流行率范围为6.8%～15.1%。 这些数据与人群中GIV.1菌株流行率较高相符。GIV.2抗体分析结果提示了动物源性NoVs 的人兽共患传播，可能归因于人与家养宠物间的相互作用。这一发现及近期记录的人NoVs传染狗，表明了人和动物NoVs进化关系的可能性。

P1841 美国印第安纳州印第安纳波利斯地区异性恋性伴侣中的新型沙眼衣原体\ Byron E. Batteiger，Raymond Wan，James A. Williams，等沙眼衣原体导致全球范围内大量的性病传播，但是缺乏可重复性和精确的菌株分型以建立伴侣间的关联。为此我们通过检测序列分型(STs)和单基因分型标准ompA基因分型的一致性来评估多位点序列分型(MLST) 。我们对2000年4月到2003年10月间收集自美国印第安纳州印第安纳波利斯地区，自报在过去30 d内建立了异性恋性伴侣关系

1.内蒙古民族大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室,通辽 028000; 2.内蒙古民族大学乳源性致病菌研究所,通辽 028000; 3.内蒙古民族大学医学院病原生物与免疫学教研室,通辽 028000 Email:jilinbl@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.020

R378.1

A

1002-2694(2015)01-0092-04

2014-07-22；

2014-11-19

内蒙古自治区自然科学基金(No.2011BS0401),内蒙古民族大学博士科研启动基金(No.BS280)