14-3-3η通过抑制内质网应激反应对H9c2心肌细胞的保护作用

王安杏 马望歌 陈方圆 黄 欣 周 娟 郭 宁▲

1.陕西省宝鸡市中医医院心血管二科，陕西宝鸡721001；2.西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，陕西西安710061

14-3-3η通过抑制内质网应激反应对H9c2心肌细胞的保护作用

王安杏1马望歌2陈方圆2黄 欣2周 娟2郭 宁2▲

1.陕西省宝鸡市中医医院心血管二科，陕西宝鸡721001；2.西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，陕西西安710061

目的探讨14-3-3η通过抑制内质网应激对异丙肾上腺素（ISO）诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用。方法构建pFLAG-14-3-3η重组表达载体转染H9c2心肌细胞，使用ISO建立心肌细胞损伤模型。将培养的H9c2心肌细胞随机分为4组：正常对照组、ISO组、ISO+pFLAG组、ISO+14-3-3η组。流式细胞仪检测H9c2心肌细胞凋亡；Western blot检测H9c2心肌细胞中半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-12、葡萄糖调节蛋白78（GPR78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达情况；采用试剂盒检测各组细胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果ISO刺激H9c2心肌细胞后，与正常对照组比较，ISO组细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），caspase-3与caspase-12的表达升高（P＜0.05），MDA含量增高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），内质网应激反应标志蛋白GPR78与CHOP的表达显著增高（P＜0.05）。转染pFLAG-14-3-3η后再进行ISO处理，与ISO组比较，ISO+14-3-3η组心肌细胞的凋亡率显著降低（P＜0.05），caspase-3与caspase-12的表达明显减少（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性增大（P＜0.05），GPR78与CHOP的表达显著降低（P＜0.05）。结论14-3-3η可以通过抑制内质网应激反应减轻ISO诱导的H9c2心肌细胞损伤。

14-3-3η；内质网应激；心肌细胞

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是机体在受到有害刺激时做出的自身保护性应答。研究表明，在细胞受到各种刺激的损害时，适宜的内质网应激对细胞有保护作用，而过长时间或过强的内质网应激会导致细胞的保护机制不能与损伤相抗衡，此时内质网稳态受到损害，使细胞凋亡[1]。内质网应激在肿瘤、糖尿病、神经性系统退行性疾病等多种疾病的发生发展中起重要作用[2]。心血管疾病是目前对人类健康威胁最大的疾病之一，近年来多项研究表明内质网应激参与了多种心血管疾病的发生发展[3]。心肌细胞凋亡是影响多种心血管疾病病理生理的重要机制之一[4-5]。最新研究发现，内质网应激参与心肌细胞凋亡的调节[6]，并且14-3-3η也参与小鼠心肌细胞的凋亡的调节[7]，同时14-3-3η对ERS诱发的细胞凋亡有抑制作用[8]。本研究通过建立异丙肾上腺素（isopro terenol，ISO）损伤H9c2心肌细胞模型，探讨14-3-3η能否通过抑制内质网应激来保护心肌细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

载体pFLAG和LipofectamineTM-2000购自Invit rogen公司；限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ、ISO、EDTA、胰蛋白酶购自Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM培养基购自HyClone公司；大鼠H9c2心肌细胞购自美国模式培养物保藏所；山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GPR78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）和β-actin一抗，HRP-标记的兔抗山羊二抗购自Pierce公司；AV/PI双染凋亡检测试剂盒购自BD公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 14-3-3η真核表达质粒pFLAG-14-3-3η的构建及转染

设计14-3-3η的PCR扩增引物，并在引物两端加入EcoRⅠ和KpnⅠ两个限制酶切位点以及保护性碱基。提取心肌细胞H9c2的总RNA进行反转录，以反转录产物cDNA为PCR模板。PCR的反应条件为94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，25个循环；最后在72℃下延伸10 min。用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切PCR扩增产物以及pFLAG质粒，收集目的片段后进行连接、筛选、质粒提取，并进行双酶切鉴定与测序鉴定。LipofectamineTM-2000与DNA以2.0∶0.8比例混合，转染心肌细胞H9c2；转染24 h后，Western blot检测14-3-3η蛋白表达评测转染效率。

1.3 心肌细胞培养与分组处理

心肌细胞H9c2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37°C，5%CO2培养箱中培养，传代后取对数期生长状况良好的细胞进行试验。细胞分为4组：正常对照组：未转染质粒，未经ISO处理，在含5%胎牛血清的培养基中培养；ISO组：在对照组的基础上加入终浓度为10 μmoL/L的ISO，进行6 h孵育；ISO+ pFLAG组：空载质粒pFLAG转染至H9c2细胞，24 h后处理同ISO组；ISO+14-3-3η组：重组表达质粒pFLAG-14-3-3η转染H9c2细胞24h后，处理同ISO组。

1.4 流式细胞法检测心肌细胞凋亡

用4℃预冷的PBS将各组H9c2细胞洗涤2次，随后加入0.25%胰酶（含0.0.2%EDTA）消化并收集细胞。加入1 mL Annexin V结合缓冲液，800 r/min离心5 min后弃上清，加入200 μL结合缓冲液重悬细胞。悬液中加入5 mg/L的Annexin V-FITC 10 μL PI 5 μL，混匀后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm为激发波长，530 nm为发射波长，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测蛋白表达

H9c2细胞被接种在35 mm培养皿内，分组处理后，加入65 μL RIPA细胞蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，进行电转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别加入1∶3000稀释的山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、GPR78、CHOP和β-actin一抗，4℃轻摇过夜；随后加入1∶100比例稀释的相应的HRP-标记的兔抗山羊二抗，室温孵育1 h，漂洗3次；最后X线胶片曝光分析，结果用Image-Pro Plus处理，以待测蛋白与内参β-actin的灰度值比值作为蛋白的相对表达量。

1.6 SOD含量测定

SOD的活性检测按照试剂盒使用说明完成。每组心肌细胞中加入酶工作液与水溶性四氮唑盐（WST）工作液，37℃恒温孵育20 min，540 nm波长处测量其吸光值。

1.7 MDA含量测定

MDA的含量，用酶联法测定。按照MDA试剂盒说明测定各组H9c2心肌细胞中MDA的含量。收集细胞，加入20%三氯乙酸（TCA）孵育20 min，随后加入0.1 mol/L盐酸（HCl）和0.67%硫代巴比妥酸（TBA）于95℃水浴1 h。离心后在532 nm波长处测量其吸光值。

1.8 统计学方法

实验数据采用统计学软件SPSS13.0分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pFLAG-14-3-3η转染心肌细胞后14-3-3η蛋白表达显著上调

Western blot结果显示，H9c2细胞转染pFLAG-14-3-3η后，14-3-3η蛋白表达显著上调（P＜0.05），表明重组表达质粒成功转染至H9c2细胞。见图1。

2.2 pFLAG-14-3-3η转染抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡率升高

结果显示：与正常组相比，H9c2心肌细胞经ISO处理后，细胞凋亡率显著增加；当转染pFLAG-14-3-3η质粒后，ISO诱导的心肌细胞凋亡受到明显抑制。见图2。

2.3 pFLAG-14-3-3η转染抑制ISO引起的凋亡蛋白caspase-3、caspase-12表达变化

为了进一步明确14-3-3η对心肌细胞凋亡的抑制作用，采用Western blot方法检测各组细胞中凋亡蛋白caspase-3与caspase-12的表达。结果表明：在ISO处理组中，caspase-3与caspase-12的表达显著升高（P＜0.05）；而在pFLAG-14-3-3η质粒转染组中caspase-3与caspase-12的表达显著下调（P＜0.05）。见图3。

2.4 pFLAG-14-3-3η转染抑制ISO诱发的细胞内MDA、SDO水平变化

结果显示：H9c2心肌细胞经ISO处理后MDA的含量显著增加（P＜0.05），SOD活性显著降低（P＜0.05）。在ISO处理前转染pFLAG-14-3-3η质粒24 h，可明显降低ISO引起的MDA含量增加（P＜0.05），并显著提高SOD的活性（P＜0.05）。见图4。

2.5 pFLAG-14-3-3η转染抑制ISO诱导的内质网应激蛋白GRP78及CHOP的表达

结果表明：GPR78和CHOP的表达在ISO处理组中显著升高（P＜0.05），并在pFLAG-14-3-3η质粒转染组中明显降低（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

近年来，心肌细胞凋亡一直是心血管领域的研究热点。14-3-3η是属于14-3-3蛋白家族其中一个亚型[9]。14-3-3蛋白家族是一类酸性二聚体可溶性蛋白，具有高度保守性，可与包括核转录因子在内的多种蛋白相互作用影响细胞功能，甚至可以与激酶、受体等蛋白结合，在信号转导、细胞生长、分裂、分化、凋亡、细胞周期等众多生理过程中发挥重要作用[10-11]。研究发现，14-3-3蛋白影响多种心血管疾病的病理进程[12]。近年来在细胞水平上对心肌细胞损伤与保护的研究已成为国内外心血管疾病研究发展的新方向。其最大的优点在于可以精确反映特定的因子对心肌细胞损伤的保护作用。β1肾上腺素受体是心脏功能调节的主要受体，ISO是该受体的激动剂，临床上主要用于房室传导阻滞、心脏休克、骤停等心血管疾病的治疗。目前常用ISO来建立缺血性心脏病以及心力衰竭的动物模型[13-15]。研究发现用ISO诱导大鼠心肌损伤，会引起心肌细胞的内质网应激反应，从而导致心肌细胞凋亡[16]。据此，用ISO建立心肌细胞损伤模型，转染含有14-3-3η的表达载体pFLAG-14-3-3η至心肌细胞H9c2中，通过研究该表达载体的转染对细胞凋亡，细胞损伤程度以及内质网应激标志蛋白的表达的影响，探讨14-3-3η对ISO诱导心肌细胞损伤的保护作用及其机制。

本研究首先检测转染了pFLAG-14-3-3η的H9c2心肌细胞中的14-3-3η的表达，发现与正常对照组相比，转染重组质粒的心肌细胞中14-3-3η的表达明显增高（P＜0.05），说明重组表达质粒能在心肌细胞中有效表达。通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示，ISO组中的细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），ISO+pFLAG-14-3-3η组的细胞凋亡率与ISO组相比显著降低（P＜0.05），提示14-3-3η对ISO诱导的细胞凋亡具有抑制作用，这一结果与国外学者观察到的结果相同[7]。本研究通过检测心肌细胞中凋亡蛋白caspase-3与caspase-12的表达，发现凋亡蛋白在ISO组中表达升高（P＜0.05），且在pFLAG-14-3-3η转染组中降低（P＜0.05），进一步证明了14-3-3η对细胞凋亡的保护作用。

本研究用MDA含量与SOD活性来衡量心肌细胞受损伤的程度，结果显示14-3-3η可减少有ISO引起的MDA含量升高（P＜0.05），并提高ISO引起SOD活性降低（P＜0.05），说明14-3-3η对ISO的细胞毒性有逆转作用，对ISO引起的细胞损伤有保护作用。已有研究证明14-3-3η对细胞凋亡的调控作用与ERS密切相关[8]。为进一步研究14-3-3η对心肌细胞损伤的保护机制，本研究检测了内质网应激标志蛋白的表达。GRP78又称免疫球结合蛋白，是公认的内质网应激信号系统的上游开关分子，是ERS的关键调节蛋白[17]。CHOP是ERS诱导的细胞凋亡的关键调节分子。正常细胞中CHOP的表达非常低，而在细胞受到刺激产生内质网应激反应时，其表达显著增加[18]。本研究结果发现，GRP78与CHOP的表达在ISO组中显著升高（P＜0.05），说明ISO可诱导心肌细胞H9c2产生内质网应激，与相关研究结果一致[16]。在ISO+ pFLAG-14-3-3η组中，GRP78与CHOP的表达与ISO相较明显降低（P＜0.05），表明14-3-3η能够抑制ISO激活的心肌细胞中的内质网应激反应。

综上所述，本研究结果证实了ISO会引起心肌细胞内质网应激反应从而诱导心肌细胞损伤，而转染重组表达质粒pFLAG-14-3-3η可以通过减轻细胞中内质网应激来降低心肌细胞损伤程度，说明14-3-3η可通过抑制内质网应激保护ISO诱导的心肌细胞损伤。

[1]Oakes SA，Papa FR.The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Human Pathology[J].Annu Rev Pathol，2014，10：173-194.

[2]Manie SN，Lebeau J，Chevet E.Cellular Mechanisms of Endoplasmic Reticulum Stress Signaling in Health and Disease.3.Orchestrating the unfolded protein response in oncogenesis:an update[J].Am J Physiol Cell Physiol，2014，307（10）：C901-C907.

[3]Wang J，Hu X，Jiang H.ER stress-induced apoptosis：a novel therapeutic target in heart failure[J].Int J Cardiol，2014，177（2）：564-565.

[4]Shen M，Wu RX，Zhao L，et al.Resveratrol attenuates ischemia/reperfusion injury in neonatal cardiomyocytes and its underlyingmechanism[J].PLoSOne，2012，7（12）：e51223. [5]Takemura G，Kanoh M，Minatoguchi S，et al.Cardiomyocyte apoptosis in the failing heart--a critical review from definition and classification of cell death[J].Int J Cardiol，2013，167（6）：2373-2386.

[6]Wang M，Meng XB，Yu YL，et al.Elatoside C protects against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes through thereductionofendoplasmic reticulum stress partially depending on STAT3 activation[J]. Apoptosis，2014，19（12）：1727-1735.

[7]Allouis M，Le Bouffant F，Wilders R，et al.14-3-3 is a regulator ofthecardiacvoltage-gated sodium channel Nav1.5[J]. Circ Res，2006，98（12）：1538-1546.

[8]Sari FR，Watanabe K，Widyantoro B，et al.Partial inactivation of cardiac 14-3-3 protein in vivo elicits endoplasmic reticulum stress（ERS）and activates ERS-initiated apoptosis in ERS-induced mice[J].Cell Physiol Biochem，2010，26（2）：167-178.

[9]Aitken A.14-3-3 proteins：a historic overview[J].Semin Cancer Biol，2006，16（3）：162-172.

[10]Bustos DM.The role of protein disorder in the 14-3-3 interaction network[J].Mol Biosyst，2012，8（1）：178-184. [11]Zhao J，Meyerkord CL，Du Y，et al.14-3-3 proteins as potential therapeutic targets[J].Semin Cell Dev Biol，2011，22（7）：705-712.

[12]Thandavarayan RA，Giridharan VV，Sari FR，et al.Depletion of 14-3-3 protein exacerbates cardiac oxidative stress，inflammation and remodeling process via modulation of MAPK/NF-κB signaling pathways after streptozotocin-induced diabetes mellitus[J].Cell Physiol Biochem，2011，28（5）：911-922.

[13]Hussain Shaik A，Rasool SN，Abdul Kareem M，et al. Maslinic acid protects against isoproterenol-induced cardiotoxicity in albino Wistar rats[J].J Med Food，2012，15（8）：741-746.

[14]Nagoor Meeran MF，Stanely Mainzen Prince P.Protective effects of N-acetyl cysteine on membrane-bound adenosine triphosphatases and minerals in isoproterenol-induced myocardial-infarcted rats：an in vivo and in vitro study[J].J Biochem Mol Toxicol，2012，26（7）：276-281.

[15]Patel DK，Desai SN，Gandhi HP，et al.Cardio protective effect of Coriandrum sativum L.on isoproterenol induced myocardial necrosis in rats[J].Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3120-3125.

[16]周昌清，倪黎，关红菁，等.β1-ar持久兴奋通过camkiiδ-内质网应激凋亡通路导致心力衰竭的机制[J].中国分子心脏病学杂志，2008，8（6）：319-327.

[17]Panayi GS，Corrigall VM.Immunoglobulin heavy-chainbinding protein（BiP）：a stress protein that has the potential to be a novel therapy for rheumatoid arthritis[J]. Biochem Soc Trans，2014，42（6）：1752-1755.

[18]Miyazaki-Anzai S，Masuda M，Demos-Davies KM，et al. Endoplasmic reticulum stress effector CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein（CHOP）regulates chronic kidney disease-induced vascular calcification[J]. J Am Heart Assoc，2014，3（3）：e000949.

Protection of 14-3-3η to H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress reaction

WANG Anxing1MA Wangge2CHEN Fangyuan2HUANG Xin2ZHOU Juan2Guo Ning2▲
1.Second Department of Cardiovascular,Chinese Medicine Hospital of Baoji City,Shaanxi Province,Baoji721001, China;2.Department of Vasculocardiology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province, Xi'an710061,China

ObjectiveTo study the effectof 14-3-3η on isoprenaline(ISO)induced H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress.MethodsThe recombinant expression vector pFLAG-14-3-3η was constructed and transfected into H9c2 cells.The cardiomyocytes injury model was established by using ISO.The H9c2 cells were randomly divided into four groups:control group,ISO group,ISO+pFLAG group,ISO+14-3-3η group.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Protein expression levels ofcaspase-3,caspase-12,glucose regulated protein 78(GPR78),and CCAAT/enhancer binding protein homologous protein(CHOP)were examined by western blot.Themaleic dialdehyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity was measured by the MDA and SOD detection kit,respectively.ResultsAfter ISO stimulating H9c2 cardiomyocytes,compared with the control group,in ISO group,the cell apoptosis increased(P＜0.05),the expression levels of caspase-3 and caspase-12 increased(P＜0.05), the content of MDA increased(P＜0.05),the activity of SOD decreased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP increased(P＜0.05).After reversed by pFLAG-14-3-3η transfection,dealed with ISO,compared with ISO group,in ISO+14-3-3η group,the expression levels of caspase-3 and caspase-12 decreased(P＜0.05),the content of MDA decreased(P＜0.05),the activity of SOD increased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP decreased(P＜0.05).ConclusionThe 14-3-3η over expression protects cardiomyocytes against ISO-induced cell injury via inhibiting endoplasmic reticulum stress.

14-3-3η;Endoplasmic reticulum stress;Cardiomyocytes

R542.2

A

1673-7210（2015）04（b）-0022-05

2015-01-04本文编辑：苏畅）

▲通讯作者