VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞立体定向移植对局灶性缺血大鼠脑血管新生的影响

邬志坚 江慧玲 陈泳晖 刘宁平

广州市番禺区中医院神经内科，广东广州511400

VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞立体定向移植对局灶性缺血大鼠脑血管新生的影响

邬志坚 江慧玲 陈泳晖 刘宁平

广州市番禺区中医院神经内科，广东广州511400

目的观察pEGFP-VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）可否促进脑缺血大鼠血管新生。方法全骨髓贴壁法分离获取第三代BMSCs，当BMSCs生长汇合率为80%～90%时以脂转法转染pEGFP-VEGF165质粒。制作大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,分为模型组、BMSCs移植组（BMSCs组）、转血管内皮生长因子（VEGF）基因BMSCs移植组（BMSCs/VEGF组）。于造模后7、14、21 d进行神经行为学评分，免疫组织化学染色检测脑缺血边缘区血管内皮细胞标志物CD34和VEGF的表达，激光共聚焦显微镜观察血管生成情况。结果BMSCs组与BMSCs/ VEGF组大鼠神经功能（BRS）评分较模型组明显降低（P＜0.01），BMSCs/VEGF组BRS评分低于BMSCs组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与非缺血侧比较，BMSCs组和BMSCs/VEGF组缺血侧微血管直径、微血管面积均较其显著增加（P＜0.05或P＜0.01）；BMSCs组和BMSCs/VEGF组微血管直径、微血管面积均较模型组显著增加（P＜0.05），但BMSCs组与BMSCs/VEGF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。7 d时BMSCs/VEGF组VEGF阳性细胞较BMSCs组VEGF表达显著增加（P＜0.05），其他时间点两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；BMSCs/VEGF组CD34阳性表达在各时间点较BMSCs组有所增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论经VEGF基因修饰的BMSCs移植可提高缺血区血管生成，仅在移植后7 d比单纯BMSCs移植VEGF表达升高有显著性差异，在神经行为学评分、微血管新生、CD34表达等方面与单纯BMSCs比较，无明显优势。原因可能与VEGF165质粒转染效率不高及脑血管新生机制复杂有关。

血管内皮生长因子；骨髓间充质干细胞；血管新生

脑梗死具有高发病率、高病死率、高致残率的特点[1]，对人类健康危害极大，探索一种治疗脑梗死的新方法势在必行。干细胞能促使损伤后的神经细胞再生和修复[2]，但是由于脑血管的闭塞，实施局部神经干细胞成功移植后，也无法有效建立侧支循环，使得移植后神经干细胞会出现明显的缺血缺氧状况而坏死。如何促进新血管生成关系到干细胞治疗急性脑梗死能否成功。骨髓充质干细胞具有多能分化作用，如何定向诱导分化，促进脑血管新生是目前研究的难点[3]。本研究拟先将血管内皮生长因子（VEGF）基因转染到骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，然后再立体定向移植到缺血的脑组织中，观察脑血管新生的情况。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠，月龄3～4个月，体重196～235 g,平均（214.6±10.2）g，购自于广州医科大学实验动物中心，许可证号：0051622。

1.2 主要仪器与试剂

pEGFP-VEGF165质粒购由中山大学干细胞研究中心提供。Lipofectamine2000脂质体购自于美国Invitrogen公司。质粒提取试剂盒购自于北京天根生化科技有限公司。兔抗大鼠VEGF抗体、兔抗大鼠CD34抗体购自于Life Technologies公司。异硫氰酸荧光素标记右旋糖酐购自于美国西格玛奥德里奇中国有限公司。SABC试剂盒、DAB试剂盒，购自于武汉博士德生物工程有限公司。激光扫描共聚焦显微镜由德国LEICA公司生产。型号为41M60032-00032的Image-Pro Plus 6.0图像分析处理软件为美国Media Cybernetics公司设计。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs与VEGF基因转染[4]

取6～8周雄性SD大鼠，取两侧股骨骨髓，将其制备成单细胞悬液，将分离获得的细胞实施细胞，将其接种到L-DMEM培养基，其成分为胎牛血清（FBS），体积分数为0.1。在培养箱中培养，培养条件如下：37℃、含5%CO2。可用差速贴壁法对细胞实施纯化，90%融合时行传代培养。取第三代BMSCs进行转染，参考筛选优化后的转染条件：细胞密度80%～90%融合度，DNA浓度6.0 μg/mL，DNA∶Lipofectamine 2000（μg∶μL）= 3∶4。转染6 h后，更换含FBS（体积分数为0.1）的LDMEM培养基，继续孵育。转染48 h收集细胞备用。

1.3.2 MCAO模型建立

对大鼠大脑中动脉实施栓塞术，2 h后可拔出栓线3～4 mm，进行再灌注。MCAO模型的成功条件如下：栓塞后对侧肢体发生偏瘫；行走时向对侧转圈。假手术组建立如下：手术时置入栓线，插入颈总动脉深度≤0.5 cm，其余操作同上。

1.3.3 分组与用药

按照脑动脉是否闭塞将大鼠分为假手术组和手术组，手术组分为模型组、BMSCs移植组（BMSCs组）、转VEGF基因BMSCs移植组（BMSCs/VEGF组）。各手术组按照取材时间点随机分为7、14、21 d三个时间点，各组各个时间点例数为5、5、8只大鼠；假手术组共大鼠5只。

再灌注24 h后使用立体定位仪在实验大鼠右纹状体区（MR＞2.0 mm，AP＞0 mm，DV＞4.5 mm)细胞悬液10 μL注射，BMSCs/VEGF组注射含5×105个转VEGF基因后的BMSCs，BMSCs组注射含5×105个BMSCs，Model组注射无血清L-DMEM。

1.3.4 标本取样

采用脂法进行转染，细胞密度为80%～90%，然后观察VEGF与CD34表达，行微血管检测。收集各组大鼠的血管内皮细胞，计数1×106血管内皮细胞备用。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能（BRS）评分

使用双盲法联合mNSS评分表对大鼠进行综合评定，内容包括肌力、意识、肌张力、反射、共济运动，以观察再灌注后大鼠的神经功能状况，测定时间为用药后7、14、21 d。

1.4.2 VEGF与CD34表达

采用免疫组化法检测，常规切片、脱蜡、水化后，使用pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液进行热修复，然后加入3%过氧化氢，以去除内源性过氧化酶的生物活性，用山羊血清进行封闭15 min，加入兔抗大鼠VEGF、CD34的一抗，在4℃下过夜，0°C PBS冲洗两次添加生物素标记羊抗兔IgG，在室温下孵育60 min，加入含辣根酶标记链酶卵白素溶液，行二氨基联苯胺（DAB）显色和苏木精复染，经酒精梯度脱水后，用二甲苯透明，再用中性树胶封片。在400倍光镜下细胞计数。

1.4.2.1 VEGF阳性表达的评定[5]光镜下观察，VEGF表达阳性细胞会染色为棕黄色颗粒或团块，且特异性位于细胞膜或细胞浆，计算切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率。其中无着色为阴性计0分，浅黄色为弱阳性计1分，棕黄色为阳性计2分，棕褐色为强阳性计3分。

1.4.2.2 CD34阳性表达的评定[6]光镜下观察，CD34阳性细胞会染色为褐黄色，其着色部位在血管内皮细胞膜上，有褐黄色着色的细胞即可认定为血管内皮细胞，计算切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率。

1.4.3 微血管检测

用药21 d后，使用苯巴比妥给予大鼠麻醉，经尾给予大鼠静注1 mL FITC-Dextran，其含量为50 mg/mL。游离状态下，FITC-Dextran循环1 min，然后断头处死大鼠，将脑半球迅速分离，在4℃下将其放入4%多聚甲醛中固定，时间48 h，再于4℃下放入20%蔗糖溶液中浸泡过夜。行OTC包埋，冰冻切片，冠状位下行连续切片，其切面平面在距前囟-5.8 mm之间与前囟5.2 mm之间，切片间隔为2 mm，厚度为100 μm，取切片5片。在栓塞及对侧的5个区域内，用激光共聚焦显微镜扫描，倍数为200，发射波长为522 nm，激发波长为488 nm，像素为512×512，扫描计算各个层面，用Image-Pro Plus 6.0图像分析处理软件进行分析，观察微血管的生成情况。

1.5 统计学方法

用SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BRS评分

假手术组动物无神经功能缺损症状，BRS均为0分。缺血再灌注大鼠存在明显的神经功能缺损症状，BRS随时间变化。移植、VEGF165转染后移植治疗后均可明显降低大鼠BRS评分（P＜0.05），BMSCs/VEGF移植组BRS评分低于BMSCs移植，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 手术组大鼠脑组织微血管定量分析

2.2.1 微血管直径

大鼠脑缺血侧的微血管有不同程度的扭曲，增加了血管通透性，FITC-Dextran可以渗透到血管及周围组织，而非缺血侧脑血管的供血正常，且结构完整。各治疗组缺血侧微血管直径均较非缺血侧显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，BMSCs组和BMSCs/VEGF组微血管直径均显著增加（P＜0.05）；BMSCs/VEGF组与BMSCs组比较，微血管直径有所增加，但无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2.2 微血管面积

大鼠脑缺血侧的微血管面积明显低于非缺血侧（P＜0.05）。BMSCs、BMSCs/VEGF组脑组织微血管面积明显大于模型组（P＜0.05）；BMSCs组与BMSCs/VEGF组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠脑组织微血管新生相关蛋白表达

2.3.1 VEGF表达

VEGF在假手术组无明显阳性表达。模型组，7 d时VEGF阳性表达最高，14 d时VEGF阳性表达下降，21 d最低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；BMSCs组与BMSCs/VEGF组的变化趋势同模型组。与模型组比较，BMSCs组与BMSCs/VEGF组大鼠VEGF阳性细胞个数在各时间点均显著增加（P＜0.01）；BMSCs组与BMSCs/VEGF组之间比较，7 d时BMSCs/VEGF较BMSCs组显著增加（P＜0.05）。见表3。

2.3.2 CD34表达

CD34在假手术组无阳性表达。模型组14 d时CD34阳性细胞较7 d显著减少（P＜0.05），21 d较14 d显著减少（P＜0.05）；BMSCs组14 d均较7 d显著减少（P＜0.05）；BMSCs/VEGF组21 d较14 d显著减少（P＜0.05）。与模型组比较，BMSCs和；BMSCs/VEGF组大鼠CD34阳性细胞个数在各时间点均显著增加（P＜0.01）；BMSCs/VEGF组CD34阳性细胞较BMSCs组有所增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

3 讨论

VEGF是相对分子质量为45 000的同型二聚体糖蛋白，也是目前为止所发现的最强有力的血管生成刺激因子，VEGF其可促使细胞外基质分解，从而趋化毛细血管内皮细胞的增殖并形成管腔。研究证实，脑梗后VEGF的各亚型及受体分别在不同细胞、不同时间表达，有程序地促进血管形成[7]。

在大脑缺血治疗方法，VEGF有一定功效，但难以穿过血脑屏障，持久效果不佳，因此一直没有被广泛推广应用，细胞转基因移植治疗的优势在细胞可穿过血脑屏障，到达脑组织所需的位置长期、稳定表达[8]。因此转基因治疗一直是脑缺血治疗研究的核心。有研究证明血流可促使VEGF基因转染家兔缺血模型缺血区域血管再生，并最终形成有功能的管腔样毛细血管[9]。

本实验采用脂质体介导pEGFP-VEGF165质粒转染BMSCs，转染率约为14%，与文献报道一致[10]。进一步试验发现，VEGF165质粒转染BMSCs立体定向移植到缺血脑组织后，大鼠的神经功能缺损较模型组在14、21 d有显著减轻（P＜0.05），但与单纯的BMSCs移植比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。移植后的微血管直径、微血管面积、CD34的表达也显示了类似的结果。但是，VEGF的表达，在移植后第7天BMSCs/VEGF组阳性表达却较单纯BMSCs移植组有显著增高（P＜0.05）。随着治疗时间延长，在14、21 d两组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

本实验结果说明，pEGFP-VEGF165质粒转染BMSCs与单纯BMSCs移植比较，促进新生血管形成和改善神经功能方面无明显优势。分析其原因可能为：脂质体转染效率太低，仅有14%，下一步可考虑采用腺病毒的方法转染，提高转染效率。学者采用Ⅰ型单纯性疱疹病毒转染VEGF165到BMSCs移植到脑缺血大鼠中，发现可减轻神经功能缺损，促进血管新生[11]。另外，血管新生机制复杂，需要多种信号通路共同参与，单一干预方式难以取效[12-13]。有报道使用地塞米松、flk-1联合转染，可减轻神经功能损害，促进脑新生血管发生[14]。量效关系也是重要的影响因素。经VEGF基因修饰的BMSCs在移植部位发挥分泌VEGF蛋白的作用，具有调节免疫、神经保护等作用，需进一步进行研究，尽早应用于临床，造福患者。

[1]刘泰，段志刚.中药针剂对脑梗塞的干预研究进展[J].中国中西医结合杂志，2013，33（10）：1434-1437.

[2]张兴秀，郭慧娟，李琳，等.缺血性脑卒中大鼠模型骨髓干细胞的动员和神经修复作用[J].第三军医大学学报，2012，34（12）：1192-1196.

[3]Hideki A，Neil RH，Shahin R，et al.Thrombopoietin Gene Transfer-Mediated Enhancement of Angiogenic Responses to Acute Ischemia[J].Circulation Research，2005，97（4）：337-345.

[4]Guo JW，Chen C，Huang Y，et al.Combinatorial effects of naomai yihao capsules and vascular endothelial growth factor gene-transfected bone marrow mesenchymal stem cells on angiogenesis in cerebral ischemic tissues in rats[J]. J Tradit Chin Med，2012，32（1）：87-92.

[5]范波胜，娄季宇，白宏英.重组双基因表达质粒pIRESNGF-VEGF165转染大鼠BMSCs及表达鉴定[J].中风与神经疾病杂志，2012，29（12）：1077-1079.

[6]吴海荣，关云艳，吴锡平，等.VEGF165b重组蛋白与贝伐珠单抗对人胃癌裸鼠移植瘤CD34表达及细胞凋亡的影响[J].世界华人消化杂志，2014，22（8）：1058-1063.

[7]宋艳玲，赖天宝，李嫚，等.VEGF基因修饰MSCs移植对脑梗死大鼠血管源性机制的实验研究[J].卒中与神经疾病，2011，18（6）：323-325，370.

[8]Kimura R，Nakase H，Tamaki R.Vascular endothelial growth factor antagonist reduces brain edema formation and venous infarction[J].Stroke，2005，36（1）：1259-1263.

[9]Rissanen TT，Korpisalo P，Markkanen JE.Blood flow remodels growing vasculature during vascular endothelial growth factor gene therapy and determines between capillary arterialization and sprouting angiogenesis[J].Circulation，2005，112（25）：3937-3946.

[10]张凡，张浩，胡盛寿，等.阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗[J].中国医学科学院学报，2005，27（4）：504-508.

[11]Miki Y，Nonoguchi N，Ikeda N，et al.Vascular endothelial growth factor gene-transferred bone marrow stromal cells engineered with a herpes simplex virus type 1 vector can improve neurological deficits and reduce infarction volume in rat brain ischemia[J].Neurosurgery，2007，61（3）：586-594.

[12]De FD，Merlini A，Laterza C，et al.Neural stem cell transplantation in central nervous system disorders：from cell replacement to neuroprotection[J].Current Opinion in Neurology，2012，25（3）：322-333.

[13]陈丹丹，付文玉，庄宝祥，等.骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用[J].中国实验动物学报，2013，21（1）：22-26，后插3-后插4.

[14]Bao X，Feng M，Wei J，et al.Transplantation of Flk-1+ human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rats[J].European Journal of Neuroscience，2011，34（1）：87-98.

Influence of VEGF165plasmid transfection BMSCs stereotactic transplantation in angiogenesis of focal ischemia rats

WU ZhijianJIANG HuilingCHEN YonghuiLIU Ningping
Department of Neurology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Panyu District in Guangzhou City,Guangdong Province,Guangzhou511400,China

ObjectiveTo observe pEGFP-VEGF165plasmid transfection BMSCs whether promote angiogenesis of focal ischemia rats.MethodsThe third generation of BMSCs were isolated by whole bone marrow adherence method.As BMSCs growth convergence rate reached 80%-90%,pEGFP-VEGF165plasmid transferred by lipid transfer method.Rats were used to make MCAO model,including model group,BMSCs group,BMSCs/VEGF group.Neurological behavior score finished after model 7,14,21 d.Expression of vascular endothelial cell markers CD34 and VEGF were tested by immunohistochemistry staining.Angiogenesis was observed by confocal laser scanning microscopy.ResultsBRS scores in BMSCs group and BMSCs/VEGF group were decreased significantly than those that in model group(P＜0.01),BRS scores in BMSCs/VEGF group were lower than those in BMSCs group,but the difference was not statistically significant (P＞0.05).Compared with non-ischemic side,microvessel diameter and area increased significantly in ischemic side in BMSCs group and BMSCs/VEGF group(P＜0.05 or P＜0.01).Microvessel diameter and area in BMSCs group and BMSCs/VEGF group were higher than those in model group(P＜0.05),but there was no statistically significant difference between BMSCs group and BMSCs/VEGF group.At 7 d,the expression of VEGF and in BMSCs/VEGF group was significantly higher than that in BMSCs group(P＜0.05).There was no statistically significant difference at other time; CD34 expression in BMSCs/VEGF group was higher than that in BMSCs group,but there was no statistically significant difference(P＞0.05).ConclusionBMSCs transplantation modified by VEGF gene can improve angiogenesis in ischemic area,VEGF expression in which have significant difference with pure BMSCs transplantation at post-transplant 7 d. Compared with pure BMSCs at neurological behavior score;angiogenesis;CD34 expression,there are no obvious advantage.Reason may be related to VEGF165plasmid transfection rate low and complex mechanism of brain angiogenesis.

VEGF;BMSCs;Angiogenesis

R743.3

A

1673-7210（2015）04（b）-0011-04

2015-01-05本文编辑：苏畅）

广东省科技计划项目（编号2010B030700049）。