早期高压氧对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑神经保护的效果探讨

姜涛， 鲍靖， 张丽华， 鲍秀芹

实验论著

早期高压氧对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑神经保护的效果探讨

姜涛， 鲍靖， 张丽华， 鲍秀芹

目的 探讨早期高压氧对缺血缺氧性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑神经保护的效果。方法 将7日龄新生Wistar大鼠120只随机分为假手术组、HIBD组、高压氧组，每组各40只。将高压氧组再随机分为早期高压氧亚组和晚期高压氧亚组，每亚组各20只。对所有大鼠建立HIBD模型后(假手术组采用假手术处理)，早期高压氧亚组在建模后1 h内，晚期高压氧亚组在建模后48 h实行高压氧治疗(2 ATA，每次90 min，24 h 1次，连续治疗7 d)。各亚组治疗结束后处死大鼠，假手术组与HIBD组处死等量大鼠。利用免疫组织化学法对大鼠海马中神经巢蛋白(Nestin)的含量进行检测，利用Morris水迷宫实验对大鼠学习记忆功能进行检测。结果 假手术组Nestin阳性细胞检出数量为(10.26±1.37)个/HP，早期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量为(15.82±2.19)个/HP，晚期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量为(32.64±4.83)个/HP，HIBD组Nestin阳性细胞检出数量为(36.18±4.02)个/HP。高压氧组和HIBD组Nestin阳性细胞检出数量显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)，晚期高压氧亚组显著高于早期高压氧亚组,差异有统计学意义(P<0.05)，晚期高压氧亚组与HIBD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；4组平均逃逸潜伏期差异有统计学意义(F=24.18，P<0.05)，假手术组<早期高压氧组<晚期高压氧组早期高压氧组>晚期高压氧组，而晚期高压氧组和HIBD组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，各组搜索速度组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 早期高压氧对HIBD脑损伤具有保护功能，Nestin蛋白可能参与了脑神经的修复过程，早期高压氧还对HIBD引起的远期学习记忆功能障碍有改善作用。

缺血缺氧性脑病； 高压氧； 脑神经； 大鼠，Wistar； 动物，实验

新生儿缺血缺氧性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)是指在围生期缺氧导致的脑缺血缺氧性损害。高压氧技术在最近几年广泛被用于治疗HIBD，被认为是目前比较有效的治疗方法。国外有报道称高压氧可以在短时间内提高血液中的氧分压，改善大脑缺氧状态，可以有效、迅速纠正脑缺血缺氧状态[1]。但目前高压氧对HIBD的作用机制尚未明了，本次研究拟通过建立大鼠HIBD模型，探讨早期高压氧对HIBD新生大鼠脑神经保护的效果，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 7日龄清洁级Wistar大鼠120只，雄性51只，雌性69只，体质量11～13 g，由佳木斯大学动物实验室提供(生产许可证：SCXK(吉)-2011-0004)。按随机数字表法将120只大鼠分为假手术组、HIBD组、高压氧组，每组各40只。将高压氧组按随机数字表法分为早期高压氧亚组和晚期高压氧亚组，每亚组各20只。

1.2 HIBD模型建立方法 采用经典Rice法制作HIBD模型[2]。将大鼠用乙醚麻醉，仰卧位固定，备皮，消毒颈部周围皮肤，沿正中线作颈部切口，找到并游离左侧颈总动脉，近心端结扎后剪断。整个过程控制在10 min内。术后2 h将大鼠放入37 ℃恒温密闭箱内，向箱内持续通氮氧混合气体，控制箱内氧浓度为70 mL/L，2 h后将大鼠取出，由母鼠喂养。假手术组大鼠只游离左侧颈总动脉后缝合。

1.3 高压氧操作方法 早期高压氧亚组大鼠在建模后1 h，晚期高压氧亚组大鼠在建模后48 h放入氧体积分数900～1 000 mL/L，压力为2 ATA的氧仓内吸氧90 min，每间隔24 h进行治疗1次，连续治疗7次。每日记录大鼠生存情况。

1.4 神经巢(Nestin)蛋白和Morris水迷宫测定方法 在实验结束的时间点，将各亚组大鼠取10只检测Nestin蛋白，另外10只进行Morris水迷宫实验。

用于检测Nestin蛋白的大鼠处死后，开胸，暴露心脏，行主动脉插管，用10 ℃生理盐水充分冲洗血液。开颅取脑后，迅速放入-35 ℃恒冷箱切片机中保存，2～3 h后沿视交叉做厚10 μm的冠状冰冻切片，经多聚赖氨酸处理后，放入20 ℃恒温箱中干燥[3]。用免疫组织化学SABC法对切片进行染色，单抗选择1∶100小鼠抗大鼠的Nestin单克隆抗体，DAB染色，Nestin蛋白在胞质内呈棕色或棕褐色为阳性。每个标本观察3张切片，每张切片在400倍镜下选取4个视野计数阳性细胞，计算平均值。

本次实验用直径为120 cm的Morris水迷宫，并均分为4个象限，在其中1个象限内放置一个略高出水面的平台，将该象限设置为平台象限。实验前24 h将大鼠放入迷宫，自由游泳3 min。测试内容：(1)定位航行。每天上午9时将每只大鼠从4个象限入水点放入迷宫，记录从大鼠进入迷宫到四肢完全爬上平台所耗时间，即逃逸潜伏期，连续测试4 d。(2)空间探索。第5日将平台撤走，将大鼠放入迷宫后，记录120 s内大鼠的行动轨迹、对原平台的搜索耗时和搜索距离，计算搜索速度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0软件对所有实验所得数据进行处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Nestin蛋白检出情况 见表1。

表1结果表明，4组大鼠Nestin蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步进行两两比较，高压氧组和HIBD组Nestin阳性细胞检出数量显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；晚期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量显著高于早期高压氧亚组，差异有统计学意义(P<0.05)；晚期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量与HIBD组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠Morris水迷宫测试结果 见表2，3。

表2结果表明，4组大鼠平均潜伏期比较差异有统计学意义(P<0.05)，进一步进行两两比较，各组大鼠的组内平均逃逸潜伏期每天均显著较前一天缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。前三天，4组平均逃逸潜伏期差异有统计学意义(F=24.18，P<0.05)，假手术组<早期高压氧组<晚期高压氧组0.05)。

表3结果表明，4组大鼠空间探索各项指标比较差异有统计学意义(P<0.05)，进一步进行两两比较，假手术组、早期高压氧组和晚期高压氧组3组大鼠在搜索耗时和搜索路程上组间比较差异有统计学意义(F=21.05，P<0.05)，均为假手术组>早期高压氧组>晚期高压氧组，而晚期高压氧组与HIBD组在搜索耗时和搜索路程上比较差异无统计学意义(P>0.05)，各组搜索速度组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

高压氧作为目前一种比较有效的治疗方法用于治疗新生儿疾病，特别是缺血缺氧性脑病已有多年历史，但由于缺乏科学的理论依据和对毒副反应的误解，在临床应用中有争议[4]。目前多数动物研究认为高压氧对新生儿缺氧缺血性脑病治疗有效，可减轻神经元损伤，促进远期功能的恢复。Nestin蛋白是一种中间丝蛋白，主要分布在神经上皮干细胞的细胞质中，是细胞骨架的重要构成部分。Hei等[5]在研究中发现Nestin蛋白在神经上皮干细胞开始迁移时，其阳性表达开始增加，迁移过程完成后，其含量逐渐下降，当神经细胞分化成熟后停止表达，故Nestin蛋白一直被认为是神经上皮干细胞的标志蛋白。杨荣等[6]在研究中发现，在大鼠建立缺血缺氧模型后，其脑内缺血缺氧区域，以及周围部分区域的Nestin蛋白阳性表达显著上升。本研究结果发现高压氧组和HIBD组Nestin阳性细胞检出数量显著高于假手术组(P<0.05)，晚期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量显著高于早期高压氧亚组(P<0.05)，而晚期高压氧亚组Nestin阳性细胞检出数量略低于HIBD组，但差异无统计学意义(P>0.05)。这说明HIBD后脑部神经细胞迅速再生以代偿因缺血缺氧而坏死的细胞，而早期高压氧组大鼠脑组织内Nestin蛋白虽然较假手术组表达显著升高(P<0.05)，但显著低于晚期高压氧组(P<0.05)，这说明早期应用高压氧对HIBD效果显著。Wang等[7]发现，高压氧疗法可以迅速提高脑内组织的含氧量以及氧储备量，对纠正脑组织缺血缺氧状态迅速、有效，且可以降低脑细胞因缺血缺氧而发生的坏死。而Zhang等[8]研究结果显示，高压氧不仅可以有效降低无氧酵解过程，纠正酸中毒状态，还对脑血管有收缩作用，从而减少脑血流量，达到降低脑水肿的目的。而对于高压氧对HIBD的治疗机制，石瑞成等[9]认为是由于高压氧状态可以增加脑内超氧化物歧化酶的含量，对缺氧产生的自由基迅速清除，提高抗氧化能力，从而可以减轻再灌注后引起的缺血-再灌注损伤过程。本次研究结果也证实了石瑞成的观点。本次研究结果证明，早期应用高压氧，对神经细胞可以起到更好的保护作用，这可能是因为在长时间缺血缺氧后，神经细胞发生了不可逆的坏死，需要神经干细胞大量增生、代偿，而这个过程十分缓慢，晚期高压氧组中Nestin蛋白的大量表达也间接证实了这一点。

Morris水迷宫是测试大鼠学习、记忆功能的有效方法，可以间接反应海马区的功能[10]。本研究结果发现，4组平均逃逸潜伏期为假手术组<早期高压氧组<晚期高压氧组0.05)，这可能是因为此次的HIBD建模还不能对大鼠的远期运动功能产生影响，而早期高压氧和晚期高压氧两组在搜索速度上差异无统计学意义，说明延迟高压氧治疗无法对远期的脑运动功能起到保护作用，而其机制有待进一步研究。

[1] Feldman J, Renda N, Markovitz GH, et al. Treatment of carbon monoxide poisoning with hyperbaric oxygen and therapeutic hypothermia. Undersea Hyperb Med，2013，40(1):71-79.

[2] Wang IC, Liu HT, Yu CM, et al. Effect of hyperbaric oxygenation on intervertebral disc degeneration: an in vivo study with sprague-dawley rats[J].Spine (Phila Pa 1976)，2013，38(3):E137-142.

[3] Li ZK, Zhang Y, Ke H, et al. Dose-effect relationship between androgen and neural protection in neonatal rats with hypoxic-ischemic braindamage and adverse effects of androgen. Zhonghua Erke Zazhi，2011，49(2):151-156.

[4] Wang D, Huang Y, Li Q, et al. Anti-apoptotic effect of ginsenoside Rg1 on neuron after neonatal hypoxia ischemia brain damage[J].Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi,2010,24(9):1107-1112.

[5] Hei M, Luo Y, Zhang X, et al. Tanshinone IIa alleviates the biochemical changes associated with hypoxic ischemic brain damage in a rat model[J].Phytother Res,2011,25(12):1865-1869.

[6] 杨荣,任东,潘诚，等.高压氧治疗复合烧伤大鼠移植皮片的生长成活:随机分组对照[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2008,12(5):899-902.

[7] Wang LL, Guo WJ, Xiong Y, et al. Study on the expression and the role of macrophage migration inhibitory factor in the brain of neonatal rats withhypoxia-ischemia brain damage[J]. Sichuan Daxue Xuebao Yixueban,2011,42(2):199-203.

[8] Zhang Q, Ding Y, Yao Y, et al. Creating rat model for hypoxic brain damage in neonates by oxygen deprivation[J]. PLoS One,2013,8(12):e83589

[9] 石瑞成,冯士军,王志刚，等.高压氧联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(19):3507-3512.

[10] Kjelkenes I, Thorsen E. Time course of the reduction in nitric oxide concentration in exhaled gas after exposure to hyperbaric hyperoxia[J]. Diving Hyperb Med,2009,39(2):77-80.

(本文编辑：刘颖)

Study on the effect of early hyperbaric oxygen in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage

JIANGTao,BAOJing，ZHANGLihua，BAOXiuqin.

JiamusiUniversityThirdAffiliatedHospital，Jiamusi154002，China.

Objective To investigate the effect of early hyperbaric oxygen(HBO) in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage(HIBD).Methods A total of 120 7-day old neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group(control group), hypoxic ischemic brain injury group(group HIBD) and hyperbaric oxygen group(HBO group), with 40 rats in each group. The HBO group was randomly divided into early hyperbaric oxygen subgroups(EHBO subgroup) and late hyperbaric oxygen subgroups(LHBO subgroup),with 20 rats in each group. After establishing the HIBD model for all rats(control group with sham operation),hyperbaric oxygen treatment was performed in EHBO subgroup after 1 h, and in LHBO subgroup after 48 h(2 ATA, every 90 minutes, 24 hours once, continuous treatment of 7 day).After treatment, the rats in subgroups were killed, and the same number of rats in the control group and HIBD group were also killed. Hippocampus Nestin in the nerve of rat was determined using immunohistochemical method, and learning and memory function in rats were tested using the Morris water maze test. Results In the control group Nestin positive cell detection rate was (10.26±1.37)/HP, in EHBO subgroup it was (15.82±2.19)/HP, LHBO subgroup (32.64±4.83)/HP, HIBD group (36.18±4.02)/HP. The detection rate of Nestin positive cells in the HBO group, and HIBD group was significantly higher than that of the control group(P<0.05), and in the LHBO subgroup it was significantly higher compared with that of the EHBO subgroups(P<0.05), while the LHBO subgroup and HIBD group had no significant difference(P>0.05); the four groups had significant differences in average EL (F=24.18,P<0.05)；the rats in control group，EHBO and LHBO group had significant difference in the search time and search distance(F=21.05,P<0.05), but there was no significant difference between LHBO and HIBD groups and among the groups in search time(P>0.05). Conclusion Early BHO has protective effect on brain injury；Nestin protein may be involved in the repair of brain nerves；early HBO can improve the future learning and memory function which is impaired by HIBD.

hypoxic ischemic brain damage; hyperbaric oxygen; cranial nerve; Wistar rat; animal,experiment

黑龙江省教育厅科学技术项目资助(12511537)；佳木斯大学科学技术重点项目资助(sz2014-002)

154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第三医院脑瘫三科

姜涛(1984-)，男，医师，2012级佳木斯大学康复医学院硕士研究生在读。研究方向：脑损伤的发病机制及其早期防治研究。

张丽华，154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第三医院脑瘫三科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.007

R-33

A

1674-3865(2015)03-0215-04

2015-04-10)