心肌球样细胞的生物来源及治疗心力衰竭潜在作用的实验研究

聂良明 张慧 王晓明 许林海

心肌球样细胞的生物来源及治疗心力衰竭潜在作用的实验研究

聂良明 张慧 王晓明 许林海

目的 探讨心肌球样细胞（CDCs）在心力衰竭治疗中的应用前景。方法 Wistar雄性大鼠24只，无菌下取大鼠心脏组织通过胶原酶消化，培养取得CDCs，采用体外培养连续传代（P1～P5），镜下观察可见CDCs团形成。采用流式细胞仪分析细胞表型，并连续观察CDCs的自我更新和心肌细胞分化能力，并用免疫组化检测CDCs中的肌钙蛋白（cTnT）的表达。结果CDCs体外呈指数生长并形成细胞团样结构，流式细胞仪检测显示：CD29、CD44、CD90和CD106为阳性，而CD34、CD45为阴性。CDCs表达了心肌细胞特异性的结构蛋白cTnT，并可在体外培养条件下产生自主搏动。结论 CDCs是具有心肌细胞分化潜能及临床应用前景的细胞供体。

心肌球样细胞（CDSs） 细胞治疗 心力衰竭

心力衰竭病死率很高，现有的医疗手段虽然可以有效改善心脏功能，但仍不能防止病情的进一步恶化。心力衰竭的治疗除了心脏移植以外，其他手段无法补偿缺失的功能性心肌[1]。尽管心脏本身具有自我更新和修复的能力，但这种内源性的修复能力不足以代偿诸如心肌大面积坏死引起的心肌细胞丧失[2]。心源性干细胞（cardiac stem cells，CSCs）与心脏组织相容性良好，因此可以更好地整合到心肌组织当中[3]。对此，我们在临床开展心脏移植的基础上，进一步通过动物实验，从细胞供体的角度，研究心肌球样细胞（cardiospherederived cells，CDCs）的干细胞生物学特性以及其在体外扩增以后的更新能力和心肌细胞分化潜能，探讨CDCs作为细胞供体用于治疗心力衰竭的可能，现将实验结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：Wistar雄性大鼠24只，体重200～300g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。（2）麻醉药品和抗凝药：异氟烷，盐酸氯胺酮，氟哌利多、万可松、肝素钠（美国Sigma公司）。（3）实验试剂：小鼠抗肌钙蛋白（cTnT）多克隆抗体、兔抗c-kit和cTnT多克隆抗体（均由美国Santa Cruz公司）；TRITC和FITC标记的羊抗兔抗血清（德国Dako公司）。（4）手术器材和实验仪器：手术显微镜（镇江中天公司，XTS-4A型），冷冻切片机（德国Microm公司，HM315R型），荧光显微镜（日本Olympus公司，IX71型）。

1.2 免疫组化检测 CO2窒息法处死动物，开胸取心脏清洗后用组织包埋液在-40～-30℃速冻成组织包块，快速切片，厚度7μm。1%冷多聚甲醛固定后，分别作HE染色和间接免疫荧光染色。免疫组化检测切片先用羊血清封闭30min，加入一抗（抗c-kit）置侧摆摇床室温下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗涤3次后加入二抗并孵育1h，最后4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色看到标记细胞核，洗涤后用Fluormount封片，荧光显微镜数码成像。

1.3 CDCs的分离、培养 CO2窒息法处死大鼠，75%乙醇浸泡3min。无菌操作下剪开大鼠腹部；沿肋骨边缘将隔膜小心剪开，打开胸腔。取出心脏清洗后，将心肌组织充分剪碎，再用PBS洗去脂肪滴，加入3倍体积的胶原酶，吹匀后转移到15ml的离心管中；37℃水浴中消化30min（每隔5min取出充分摇匀），100目滤网过滤；FicollR400梯度离心，弃上清液，用基础培养液（低糖DMEM培养液、30%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺，pH 7.2）重悬细胞，接种到T25培养瓶中；第3天进行观察换液，弃未贴壁细胞，之后换液1次/3d；细胞铺满瓶底70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，0.04ml/cm2）消化后传代，传代比例为1∶3，标记为第一代细胞（P1），之后换液1次/3d，细胞近单层融合时传代，分别标记为Pn（n=1、2、3……）。

1.4 CDCs的自我更新能力测定 取分离的原代细胞，通过体外连续传代，分析观察传代细胞形成克隆样结构的数目，以此表明其自我更新能力，培养传代。

1.5 流式细胞仪检测CDCs表面标记 取P3细胞，待细胞生长至90%铺满时，用0.25%胰蛋白酶消化分离，离心后用PBS重悬细胞，调整细胞密度为3.0×106/ml。根据需要，将100μl细胞悬液分装于2ml离心管，并按量于各个样品管内加入相对应的抗体，包括：CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105（1∶100～200稀释）。4℃避光孵育30min后，于每样品管内添加2ml PBS，离心后弃上清液，分离游离抗体。最后，每样品管加入500μl PBS，重悬细胞，上机检测。

1.6 CDCs中cTnT表达测定 将P3的CDCs接种于细胞培养玻片中，3d后作免疫组化染色。培养玻片先抽去培养液，用1%冷多聚甲醛固定后用羊血清封闭30min，加入一抗（cTnT）置侧摆摇床室温下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗涤3次后加入二抗并孵育1h，最后作DAPI染色，洗涤后用Fluormount封片，荧光显微镜下数码成像。

2 结果

2.1 大鼠心脏组织免疫组化检测结果 见图1。

图1 大鼠心脏组织免疫组化检测结果（图中箭头示c-kit阳性细胞，右下标记示100μm）。

由图1可见，大鼠心肌组织中部分间质细胞呈ckit阳性染色，以c-kit为特征的阳性细胞普遍存在于大鼠心肌组织中，提示成年大鼠心脏中富含c-kit阳性为特征的CSCs。

2.2 CDCs的培养和自我更新能力 见图2。

图2 CDCs传代培养结果（图中箭头示c-kit阳性细胞，左下标记示100μm）。

由图2所见，观察传代后CDCs的形态和形成心肌球样结构的能力，结果显示，CDCs在反复传代以后，分离培养的CDCs在体外连续传代至P5，同样可以形成心肌球样结构，大约每低倍视野（×10）中（6.82± 2.96）个细胞团，表明CDCs具有连续自我更新能力。

2.3 流式细胞仪分析结果 见图3。

由图3可见，CDCs体外培养3代后，CD29、CD44、CD90、CD105阳性，CD34、CD45阴性，表明分离的细胞具有间充质干细胞的特征。

2.4 CDCs免疫组化分析结果 见图4。

由图4可见，用免疫组化的方法检测传代后的CDCs（P5），发现传代以后的CDCs在常规的培养条件下，细胞团中心的部分细胞已经呈cTnT阳性染色（图4A），并可以分化成自主搏动的细胞（图4B）。cTnT是心肌细胞特异性的结构蛋白，仅表达于成熟心肌和心肌前体细胞。CDCs呈cTnT阳性染色，表明CDCs是心肌细胞的前体细胞，具有比较强的分化成成熟心肌细胞潜能。

图3 流式细胞仪分析结果

图4 CDCs免疫组化分析结果（A：蓝色为DAPI细胞核染色；B：箭头所指分化成自主搏动的细胞；左下标示为100μm。）

3 讨论

心力衰竭目前有效的治疗手段为心脏移植，但由于心脏供体的短缺，心脏移植的大规模临床应用在很大程度上受到了限制。再生医学研究的科学家们目前正在致力于细胞移植技术，修复和改善由于心肌损伤后的心功能不良[2]。最近研究表明，心脏本身具有自我更新和修复能力，其再生和修复过程与内源性的CSCs有关[4]。但这种内源性的修复能力不足以代偿诸如心肌大面积坏死引起的心肌细胞丧失[2]。目前，科学家们正在探究如何刺激心脏本身的内源性的修复能力，促进损伤心肌的修复和再生。

干细胞是指还没有完全发育为成体细胞、具有演变成特定器官潜力的细胞。由于心肌细胞是终末分化细胞，无法进入细胞周期，缺乏自我更新能力[5]。近十年来，随着干细胞定向心肌细胞分化技术的成熟，通过心肌成形术手段修复损伤心肌成为治疗缺血性心脏病最有前景的治疗方法之一[2]。然而，细胞供体的选择很大程度上直接影响到细胞治疗的质量。早期开展的胚胎干细胞和最近发现的诱导的多能干细胞由于其伦理学问题和分化成畸胎瘤的危险性以及这些细胞的免疫排斥反应，很大程度上制约了进一步的临床应用[5]。目前正在实施的干细胞治疗缺血性心脏病的临床试验，主要采用自体的骨髓干细胞和脂肪干细胞。多中心的Meta分析显示，细胞治疗仅有微弱心功能改善效果，其主要问题是这些非心源性成体干细胞在心脏中的低成活率[6]。因此，选择合适的供体细胞来源，直接影响到细胞治疗的临床疗效。

CDCs可能是心血管系统在胚胎发育过程中第二心区残留的特殊细胞群，是一种特殊的CSCs。心脏第二心区的细胞主要来源于流出道附近，进一步迁移至室间隔和心室表层，发育成心外膜，冠脉系统和部分心外膜下心肌[3，7]。当心脏发育成熟以后，这些细胞可以会继续存在于成体心脏的细胞间质中。因为CDCs代表了心脏组织的内源性的修复和再生能力，当心肌损伤时，CDCs可能参与心机损伤以后的自我更新和修复作用。因此，通过体外扩增手段，就可以放大心脏的修复能力，通过细胞移植技术，补充缺失的心肌细胞，改善心功能[2]。我们通过消化分离CDCs，并用流式细胞仪分析这些细胞的的免疫表型，发现CDCs与机体的其他组织的骨髓基质细胞（MSC）有很大的类似，比如，CDC和MSC都是CD90和CD105阳性细胞群，CDCs并不是一种单一的细胞群，同时也可能是c-kit阳性，也可能是sca-1和flk-1阳性细胞。利用这些细胞表面的标记蛋白，可以成功分离和纯化心肌组织中的CDCs[8]。Chong等[9]在2011年进一步实验证明了确定CDCs是心脏固有的干细胞，并可以形成成纤维细胞样克隆样结构（CFU-FS），并具有多向分化的细胞潜能。

自从CDCs被发现以来，其心源性和组织兼容性受到了广泛的重视，并已经开展了大量的动物实验研究[10-12]。由于CDCs是心脏组织中特有的间质干细胞，因此，CDCs的自我更新能力是体外培养扩增的必要前提。我们的实验结果表明，从心脏组织活检标本中获得的CDCs可以在体外连续传代，并具有自我更新能力（形成CDCs细胞团）。这一生物学特征，可以满足将来临床应用的条件，即从小块心肌活检组织中分离心脏干细胞，并在体外扩增至临床治疗的数量级的细胞数（大约108个细胞）。最主要的是，CDCs经过连续传代以后，其心肌细胞的分化潜能并没有改变。因此，结合以往的在体实验结果，本实验为将来利用CDCs治疗缺血性心脏病和心力衰竭提供了实验基础。动物实验的研究结果同时推动了CDCs的进一步临床研究，目前《Lancet》杂志分别发表了两项评估自体CDCs冠状动脉内注射的可行性和安全性研究成果（代号分别为SCIPIO和CADUCEUS）[10，13]。美国加州和肯塔基州的两个研究团队分别通过导管技术获得患者的心房和心室的组织标本，通过体外分离培养，获得纯化的CDCs细胞，并进一步扩增后，再注射到患者的梗死心肌区域（其中SCIPIO有16例患者，CADUCEUS有17例患者）。研究结果显示，CDCs细胞移植可以减少心肌梗死以后的瘢痕形成，改善心脏的收缩功能。但是由于这些研究都是小样本并缺乏有效的对照患者，所以，CDCs的临床研究需要大样本和多中心的进一步研究。

CDCs可以从心脏组织活检标本中获得，可以准备患者特异性的干细胞供体，减少免疫排斥反应。由于CDCs具有自我更新能力，可以在体外扩增至临床应用的数量级的细胞数。同时，CDCs具有较其他来源的干细胞（例如骨髓干细胞和脂肪干细胞）拥有更好的心脏组织相容性。因此，CDCs是一种非常有实际临床意义的细胞供体来源；不过，治疗心力衰竭的临床疗效仍然需要进一步的研究。

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Biological origin of cardiosphere-derived cells and their therapeutic potential for heart failure

NIE Liangming,ZHANG Hui,WANG Xiaoming,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

【 Abstract】 Objective To investigate the differentiation potential of cardiosphere-derived cells(CDCs)after expansion in vitro.Methods CSCs were isolated by enzymatic digestion of cardiac issue from 24 Wistar rats and their immunological phenotypes were analyzed by using FACS and immunohistological staining.After expansion up to 5th passage,the ability of self-renewal and myogenic potential were analysed. Results The isolated cardiac stem cells(CSCs) grew exponentially and exhibited a similar morphology to cardiosphere.FACS analysis revealed positive for CD29,CD44, CD90,CD106and negative for CD34,CD45.Small fractions of CSCs were undergoing myogenic differentiation,evidenced by the expression of cardiac structural proteins(cTnT)and developing spontaneous contraction. Conclusion CDCs retain myogenic potential after in vitro expansion and thus may be used as donor cells for cardiac plasticity.

Cardiosphere-derived cells Cell therapy Heart failure

2014-09-02）

（本文编辑：杨丽）

浙江省医药卫生科技计划项目（2013KYA021）

310014 杭州，浙江省人民医院心胸外科（聂良明、许林海），手术室（张慧）；南京明基医院心胸外科（王晓明）