Livin shRNA表达载体的构建及在胰腺癌细胞的效应研究

张财明 季一鸣 朱敏 吕尚东 王爱东

Livin shRNA表达载体的构建及在胰腺癌细胞的效应研究

张财明 季一鸣 朱敏 吕尚东 王爱东

目的 构建Livin shRNA真核表达载体，探讨干扰质粒稳定转染的胰腺癌panc-1细胞系效应。方法 合成Livin基因干扰序列并定向插入到RNA干扰（RNAi）真核表达载体pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi质粒，通过测序进行鉴定。干扰质粒经脂质体Lipofectamine 2000介导转染panc-1细胞。经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。定量RT-PCR检测所筛选克隆Livin mRNA的转录水平，采用western blot验证Livin蛋白表达水平改变。结果 测序证明Livin干扰序列及读码框正确，干扰质粒稳定转染的panc-1细胞在倒置荧光显微镜下呈明亮绿色荧光，定量RT-PCR和western blot检测结果显示Livin shRNA序列对胰腺癌细胞系Livin mRNA及蛋白表达均有抑制作用。结论 成功构建Livin shRNA真核表达载体，建立Livin shRNA质粒稳定转染的panc-1细胞系可为进一步研究Livin在胰腺癌细胞中的作用奠定基础。

Livin基因 RNA干扰 转染 panc-1细胞

Livin基因又名KIAP/ML-IAP基因，定位于染色体20q13.3，是一个新近发现的凋亡抑制基因（inhibitor of apoptosis protein，IAP），属于IAP家族中一个重要的成员，其意义接近于survivin基因，其在肿瘤细胞抗凋亡机制和耐药机制的形成中都有重要意义。本研究探讨Livin shRNA序列对胰腺癌细胞系中Livin基因的抑制作用，为以Livin基因为靶点的肿瘤基因治疗提供实验依据，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小干扰（siRNA）干扰片段和引物由捷瑞公司（上海）合成，限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA连接酶、脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNA干扰（RNAi）载体购自Promega公司，无内毒素质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司、Livin多克隆抗体购自GeneTex公司，GAPDH为杭州贤至生物公司产品，ECL prime为美国GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 shRNA设计和重组体的构建 根据GenBank数据库Livin基因序列（NM-022161），参考siRNA的设计原则（siRNA的结构为BamHI+sense+Loop+Antisense+终止信号+HindⅢ）。设计Livin RNAi打靶序列3条，其中Livin-1为5′-CAGGCCATCAGGACAAGGT-3′；Livin-2为5′-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3′；Livin-3为5′-GGAGAGAGGTCCAGTCTGA-3′。在sense与antisense序列中间为9个插入序列TTCAAGAGA，形成发夹环，并在寡核苷酸片段的5′和3′端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，使其能与pGCsilencerTM U6/ Neo/GFP/RNAi载体连接。用30μl退火溶液溶解合成的2 OD DNA单链合成片段，94℃水浴退火，自然冷却至室温。1%琼脂糖凝胶回收大片段，稀释退火片段Livin，分别与线形化pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi质粒表达载体连接。各取5μl过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，分别涂布于含氨苄抗性（终浓度为100ng/μl）的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含氨苄抗性（终浓度为100ng/μl）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒，将鉴定证实后的细菌培养扩增，取1管送上海桑尼生物公司测序验证。

1.2.2 panc-1细胞的稳定转染及荧光显微镜观察将5×104细胞种植于6孔板，培养16h，待细胞融合率达70%时，将0.8μg RNAi干扰质粒和2μl Lipofectamine 2000分别加至50μl无血清DMEM（高糖）培养液中，轻轻摇匀，5min后将两者混匀，室温放置15min，再将其加入PBS漂洗后的panc-1细胞，边加边轻轻混合，转染混合液总体积为2ml。将转染后的细胞置37℃、5%CO2的孵箱中孵育6h后弃去转染液，加入含10%胎牛血清的1640培养液中继续培养至24h，收集部分细胞，用于总RNA抽提。另取部分细胞按1∶10稀释，将其转种于另一培养板，再经过24h后，向培养液中加入终浓度为500μg/ml的G418进行抗性筛选，1周后荧光显微镜下可见有细胞克隆发出荧光，对阳性克隆进行有限稀释，扩大培养后获得稳定表达的细胞株。

1.2.3 定量RT-PCR检测所筛选克隆Livin mRNA的表达 取Trizol试剂提取的细胞总RNA 2μg，逆转录合成cDNA，以野生型panc-1细胞为对照。Livin基因引物F：5′-ATGGGACCTAAAGACAGTGCC-3′；引物F：5′-GCGGCCAGTCATAGAAGGAG-3′；β-actin引物F：5′-AAGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′；引物R：5′-TTAATGTCACGCACGAT-TTCC-3′，由上海基康生物公司合成，取0.1μg cDNA作模板，分别扩增Livin和β-actin基因。20ul体系含cDNA 0.1μg、10μM/L上游和下游引物、2×Faststart universal SYBR Green Master（含Rox）10μl，灭菌双蒸水补足至20μl。扩增程序为：预变性95℃2min；95℃15s、60℃1min，40个循环；最后作溶解曲线分析，95℃ 15s、60℃ 1min，95℃ 15s、60℃15s。用ABI7300进行PCR扩增和分析。

1.2.4 Western blot鉴定Livin shRNA沉默效果 取稳定转染RNAi-Livin建系的panc-1细胞系对数生长期细胞，抽提总蛋白，以野生型panc-1细胞为对照。取各组细胞抽提蛋白10μg，加适量5×上样缓冲液，经煮沸变性后，行10%SDS-PAGE电泳（80V，120min），切取含目的蛋白凝胶，转膜15V，25min。用含3%BSA的PBST 4℃封闭过夜，Livin抗体（1∶2 000），GAPDH多抗（1∶1 000）4℃标记过夜，PBST洗涤5次后，标记二抗（1∶10 000），洗膜后，ECL显色，曝光，显影并定影，成像分析。

2 结果

2.1 重组Livin shRNA真核表达载体的测序结果 见图1。

由图1可见，所获得的重组干扰质粒目的片段与预期相符，表明退火形成的干扰寡核苷酸成功连接入pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi载体。

2.2 重组shRNA载体转染panc-1细胞后荧光显微镜下观察所见 见图2。

由图2可见，由于pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/ RNAi载体带有绿色荧光报告基因，因此，干扰载体pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi-Livin shRNA转染成功的panc-1细胞会发出绿色荧光，表明panc-1细胞中有转染的外源基因表达。

2.3 定量RT-PCR检测结果 见图3。

由图3可见，siRNA-Livin干扰序列对胰腺癌panc-1细胞Livin mRNA有抑制作用，尤其是打靶序列Livin-1的沉默效果与野生型panc-1细胞差异明显，而打靶序列Livin-2和Livin-3对其mRNA转录水平无明显抑制效应。

2.4 Western blot检测蛋白表达水平结果 见图4。

由图4可见，野生型panc-1细胞Livin蛋白呈阳性表达，经导入外源性shRNA-Livin-1后，其蛋白表达水平明显下降。

3 讨论

胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，其发病率近几年来呈上升趋势。在美国，胰腺癌占消化道肿瘤患者死亡原因的第2位；在我国，近20年来其发病率也增加了约40%。胰腺癌病情隐匿，早期症状不典型，发展迅速，具有高度侵袭性，预后差，大多数患者确诊时已属晚期，手术切除率较低，5年生存率低于4%。胰腺癌对现有的化疗、放疗及免疫治疗效果也均不理想，迫切需要寻找新的治疗手段。随着分子生物学和基因组学的发展，胰腺癌的基因治疗已经在多个方面取得了突破性进展，已成为治疗肿瘤的希望所在。研究表明胰腺癌的发生涉及到多种癌基因、抑癌基因、生长因子、细胞黏附因子及DNA修复基因等的异常和积累，基因治疗有可能成为胰腺癌治疗的发展方向。

图1 重组Livin shRNA真核表达载体测序图（A、B、C分别为Livin-1、Livin-2和Livin-3的siRNA序列）

图2 重组shRNA载体转染panc-1细胞后荧光显微镜下观察所见[A：重组shRNA载体转染panc-1细胞后24h（×100）；B：重组shRNA载体转染panc-1细胞后阳性克隆细胞培养（×100）]

图4 Western blot检测胰腺癌细胞panc-1转染前后Livin蛋白表达差异（1：未转染组；2：转染组）

图3 定量RT-PCR检测结果

RNAi技术是近年发展的一项特异性抑制基因表达的新方法，是双链RNA导入细胞或通过载体在细胞内转录成具有发夹结构的双链RNA，能够高效特异地剔除同源基因表达，形成相应的功能缺陷表型的一种技术，其机制是RNAi在真核细胞中的发生过程是通过一个被称之为Dicer的酶，将dsRNA裂解成21-25核苷酸的siRNA。siRNA变成细胞内RNA诱导沉默复合体的一部分，该复合物通过互补靶定将要降解的细胞内的mRNA，最终将细胞中的基因表达阻断，随着对siRNA研究的不断深入，越来越多的研究显示siRNA在基因治疗的潜在优势。与其他几种基因封闭技术相比，siRNA具有更强大、更持久的抑制基因表达的能力，其效能是反义寡核苷酸100～10 000倍[1]；siRNA具有序列特异性高、无免疫原性及体积小等优点，这就为治疗癌症这类由于多基因表达失调导致的疾病提供了可能[2]。利用RNAi技术沉默特定基因，可实现快速、高效、个体化的基因治疗，在疾病的基因治疗上有广阔的应用前景[3]。采用RNAi技术在膀胱癌、乳腺癌、白血病、原发性肝癌等人类肿瘤细胞株体外﹑体内抑制实验中均己获得了成功[4-5]。

凋亡不足是恶性肿瘤对化学治疗及放射治疗产生耐受的重要因素，因为许多抗肿瘤治疗是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。如何抑制抗凋亡基因的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡，是目前肿瘤靶向治疗的新方向。Livin是最近发现的IAP家族的新成员，在正常成人的大多数终末组织中（除胎盘）表达极低，甚至不表达，但在胎儿发育过程中，多种组织以及多数恶性肿瘤中高表达。大量研究资料表明，Livin在恶性肿瘤组织中异常高表达且不存在组织特异性，恶性黑色素瘤、鼻咽癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、淋巴瘤等癌组织均可高表达[6-8]。国外研究者使用具有靶向作用的siRNA干涉内源性Livin基因的表达，使Livin基因沉默而不表达蛋白，在使用阿霉素、紫外线照射以及TNF等凋亡促进剂治疗后，凋亡率大大增加[9-10]。上述研究表明，通过抑制Livin能显著提高肿瘤细胞对促凋亡刺激的敏感性，抑制其表达可望成为治疗恶性肿瘤的新方法。

在本实验中，我们针对Livin基因的编码区设计了shRNA序列，采用RNA干扰技术，成功构建了能在真核细胞中表达Livin shRNA序列的载体，并导入胰腺癌细胞，建立了稳定转染的panc-1细胞系，同时通过定量RT-PCR检测显示该RNAi-Livin干扰序列能有效沉默胰腺癌panc-1细胞Livin基因的表达，为以Livin基因为靶点的胰腺癌基因治疗提供了重要的实验依据。

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Construction of LivinshRNA vector and its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cells

ZHANG Caiming，JI Yiming，ZHU Min，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000, China

【 Abstract】 Objective To construct LivinshRNA eukaryotic expression vectors and to investigate its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cell line panc-1. Methods Livin gene interference sequence was synthesized and inserted into pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi vector，which was confirmed by sequencing.The recombinant RNAi vector was transfected into pancreatic cancer panc-1cells by Lipofectamine 2000.The cells containing stable transformants were selected by G418,and isolated with limited dilution.The mRNA expression of Livin in the selected clones was detected by RT-PCR,the protein expression of Livin was detected by Western blot. Results The successful construction of RNAi eukaryotic expression vectors targeting Livin was confirmed by sequencing,which was expressed in panc-1 cells after transfection as showed by green fluorescence under inverted fluorescence microscope.RT-PCR and Western blot revealed that the expression of Livin mRNA and protein was down-regulated in panc-1 cells. Conclusion Livin shRNA eukaryotie expression vector was successfully constructed and the transfected pancreatic cancer panc-1 cells show a down-regulated expression of Livin mRNA and protein．

Livin gene RNA interference Transfection panc-1 cell

2014-07-11）

（本文编辑：杨丽）

台州市科技局计划项目（102KY09）

317000 台州恩泽医疗中心（集团）浙江省台州医院肝胆外科

季一鸣，E-mail：jiymjiym@163.com