人生长素对雌性大鼠心力衰竭心脏重塑及心肌细胞凋亡的影响

孙宇泽 李艳丽 赵 勇 袁 寰 田国忠 李梅秀

各种病因所致心力衰竭( HF) 严重威胁人类的健康。AMI 发生率不断升高与患者逐渐年轻化的趋势使之成为制约现代人生活质量的主要元凶［1，2］。GHRPs 是20 世纪70 年代合成的可以强烈促进生长激素( growth hormone，GH) 释放的一族寡肽，与同样作用的非肽类化合物被合称为生长激素促分泌素( growth hormone secretagogues，GHSs)［3］。GHRPs 受体即GHS-R 的成功克隆，不仅使其代谢生长调节等内分泌功能广为关注外，也因其不依赖于GH 轴的广泛生物学活性特别是GHRPs 的心血管保护效应越来越受到医学工作者的重视［4］。GHS -R 发现后随之发现了内源性的配基天然ghrelin，又称生长素［5，6］。至此，这族GHS 被冀望于新世纪HF 生物学治疗的最有前途的遴选药物。ghrelin 由28 个氨基酸组成，是一种新的GHRPs，最初是从大鼠的胃壁组织中作为GHS-R 的配体被确认并提取，其功能不仅是GH 轴的调节，还因通过其广泛分布中枢和外周而发挥独立于GH 轴的生物活性，进来，生长素的心脏保护效应正在受到日益瞩目，而其细胞及分子机制的研究及可能的临床试用成为目前研究的重点［6］。为此，在本课题组及其他课题组初步探究了人ghrelin 对AMI 雄性大鼠影响基础上，设计以AMI 诱导成年雌性Wistar大鼠HF 模型，探索人ghrelin 对雌性HF 大鼠心肌重塑、细胞凋亡的影响，为GHRPs 应用于HF 生物学治疗、为人内源性ghrelin 作为HF 生物学治疗的新靶点进入临床应用提供必要的实验资料。

材料与方法

1.实验动物：成年健康雌性Wistar 大鼠，平均体质量280±30g，共50 只，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，适应性饲养后按体重随机分为正常组( A 组) 、假手术组( B 组) ，其余用于AMI 模型制作，符合标准的再分为单纯AMI 致HF 模型组( C 组) 和HF+人ghrelin 组( D 组) 。

2.主要仪器和试剂：RM6240 多道生理信号采集处理系统( 成都仪器厂) ； 小动物呼吸机3 台： HX -300、HX -300S( 成都泰盟科技有限公司) ；DHX-150( 成都仪器厂) ；YC -6C 生物组织摊烤片机( 湖北省孝感市亚光医用电子技术研究所) ；LEICA CM 1100 冷冻切片机( 德国) ；LEICA SM 2000R 滑动式切片机( 德国) ，Nikon YS100 生物显微摄像和分析系统( 日本) 。人ghrelin( 以色列) ，TUNEL 凋亡检测试剂盒( Roche 公司) ，其他试剂为国产试剂纯。

3.建立AMI 大鼠模型及分组处置： 于平左心耳下缘水平结扎LAD，在RM6240 多道生理信号采集处理系统大鼠胸前第Ⅱ导联检测心肌供血变化，以ST-T 段显著、持续抬高为结扎成功、以B 型超声检测左心室射血分数( ejection fraction，EF) ＜45%为达到HF。不符合条件的非标准模型淘汰后： D组给人ghrelin 40μg/( kg·d) 经尾静脉注射进行干预3 周。麻醉下取材心肌梗死部位左心室心肌组织经4%多聚甲醛固定后分别严格按照TUNEL 试剂盒说明和HE 染色步骤进行操作，封片干燥后Nikon YS100 生物显微镜下观片并拍摄。心肌细胞凋亡指数( apoptotic index，AI) 以不重叠的7 个视野计数，AI( %) =凋亡细胞数÷细胞总数×100%。

结 果

1.AMI 致HF 模型制作ECG 结果： RM6240 多道生理信号采集处理系统AMI 模型制作结扎LAD 术中大鼠胸前Ⅱ导联即时监测心肌供血变化，结扎后STT 段弓背向上持续抬高即为AMI 制作成功，经B 型超声5 个心动周期检测EF ＜45%为可用HF 大鼠模型，用于后续实验，假手术ST -T 段不明显抬高或一过性升高并迅速回落为成功。

2.ghrelin 对AMI 致HF 心肌结构的影响HE 检测结果：HE 染色可见HF 即C 组与B 组比较，心肌细胞大部分肿胀、着色极为不均、颗粒变性、细胞核固缩多、心肌排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润、间质纤维化；而ghrelin 干预的D 组则心肌细胞也有肿胀但范围明显减小、粒细胞浸润及间质纤维化均较轻、着色较均匀； 与A 组比较，B 组心肌组织着色、心肌纤维排列、炎性细胞浸润等均未见明显差异( 图1) 。

图1 HE 染色检测心肌组织结构( HE，×400)

3. ghrelin 对AMI 致HF 心肌细胞凋亡影响TUNEL 检测结果： TUNEL 染色可见HF 即C 组与B组比较，心肌细胞细胞核被染成棕褐色呈现大量特异性凋亡、可见大量炎性细胞浸润；而ghrelin 干预的D组则见较少特异性细胞凋亡； 与A 组比较，B 组未见特异性细胞凋亡见图2。D 组与C 组凋亡指数比较明显降低，差异具有统计学意义( P ＜0.05) ，表1 中列出B、C、D 组心肌细胞凋亡指数( AI) 。

图2 TUNEL 染色检测心肌组织细胞凋亡检测( TUNEL，×400)

表1 AMI 致HF 大鼠心肌细胞凋亡指数及ghrelin 对其影响(±s，%)

表1 AMI 致HF 大鼠心肌细胞凋亡指数及ghrelin 对其影响(±s，%)

组别 假手术组( B 组)HF 模型组( C 组)HF+人ghrelin 组( D 组)AI 7.3 +1.5 39.3 ±1.5*31.3 ±1.2

讨 论

随着时代的进步和经济的快速发展，人们的生活发生着日新月异的变化，生活节奏的加快滋生了生活方式疾病，新的疾病谱也应运而生，人类的健康与保健意识、措施也在相应变化。一方面寿命延长，让中国逐步进入了老龄化社会，因HF 是各种心脏疾病的终结归宿，其复杂性、严重性都注定了HF 的治疗是一项耗费巨大的医疗支出； 同时，出现了许多老年致命疾病发病年龄提前、发生率逐年升高的趋势。AMI是最常见的危重心脏病，其发病年轻化且高发的趋势是现代直接危害中青年骨干人群健康的元凶［1，7，8］。AMI 瞬间毙命的结局引起相当恶劣的社会效应，亟需医学工作者为中青年及老年人的AMI 患病风险及早做出预警，并在发病后提供最有效的挽救生命的措施，因此，这是一个多元化需求的新医疗时代［9］。所以，对AMI 的预防、抢救的新攻略研究迫在眉睫。AMI 后心肌组织因缺血坏死不仅急剧加重原有心脏病病情导致心功能骤然下降至HF，而且还因大面积心肌梗死直接诱发HF，因此，AMI 可作为一种较理想的HF 诱导方法［10］。

多数研究避开雌雄性别差异而选择雄性为研究对象，但雄性对象研究结果并不能完全替代雌雄研究资料。有研究结果证明男性、女性在AMI 乃至其后的HF 发生率方面存在显著差异［11］。GHRPs 及人和哺乳动物体内共有的天然生长素即ghrelin，通过其广泛分布的心血管系统特异受体，发挥着生长激素-胰岛素轴以外的心血管保护效应，被视为新世纪最有前途的HF 生物学治疗遴选药物［12～15］。因此，亟需大量实验研究全面阐述其心脏保护活性机制，然而，即使使用雌性大鼠研究AMI 后HF 观察的亦是大鼠天然生长素的作用，而缺少对人类天然生长素生物学效应及机制的实验资料，制约了人ghrelin 作为HF 生物学治疗新靶点应用于临床的步伐［12］。

本实验即是通过较高位置结扎LAD 使得成年雌性大鼠心功能急剧下降至＜45%直接诱导HF，HF 后大鼠心脏结构发生代偿性重构变化即心肌纤维化。本实验心肌组织HE 染色结果证实了AMI 后诱导的HF 心脏发生结构重塑，显示了增加外源性的GHRPs即给人天然ghrelin 能够减轻HF 心脏的结构重塑；TUNEL 染色结果又复证明了AMI 致HF 后的心脏大量心肌细胞凋亡及人ghrelin 抑制HF 心脏心肌细胞凋亡的发生，与课题组前期完成的研究补充了ghrelin对AMI、HF 大鼠的作用部分实验资料，为进入临床发挥HF 生物学治疗作用提供有力佐证［16］； 性别差异在AMI 乃至HF 病理进程中的差异及内源性ghrelin的变化有待于今后进一步研究，雄性大鼠AMI 致HF模型及相关项目研究业已完成，二者之间的比较及其他实验数据发表待后续完成。

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