基于红细胞溶血贫血探讨地中海贫血患者证候季节变化的生物学机制

褚娜利 张新华 方素萍 程艳玲 王文娟 吴志奎

地中海贫血是先天性基因缺陷致使人体不能正常合成血红蛋白珠蛋白引起的一种遗传性血液病，也叫珠蛋白合成障碍性贫血［1］。地中海贫血由于血红蛋白珠蛋白基因缺陷而导致肽链失衡，使得过剩的珠蛋白肽链沉积于红细胞膜，出现免疫损伤，诱发氧自由基反应，继发性酶和代谢异常，导致红细胞变形和机械稳定性下降，最终导致溶血和无效造血，引起一系列临床综合征［2］。最近研究发现，地中海贫血患者在不同的季节病情的严重程度不同，夏季溶血严重，冬季有所缓解，地中海贫血严重程度与季节变化有关［3，4］。为进一步证实地中海贫血患者在气温高的季节( 夏季) 比气温低的季节( 冬季) 溶血贫血严重，并探讨证候季节变化的生物学机制，吴志奎课题组于夏季(7 月份) 和冬季( 11 月份) 对11 例地中海贫血患者，观察冬夏两个月份地中海贫血患者血液参数和中医证候量化评分水平的差异，并检测冬夏两个月份红细胞溶血贫血相关指标水平差异，初步探讨地中海贫血患者证候季节变化的生物学机制，现报告如下。

资料与方法

1.诊断标准：西医诊断标准按照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》中地中海贫血的诊断标准进行诊断。中医辨证诊断标准及辨证标参照《中西医临床血液病学》和《中药新药临床研究指导原则》［5～7］。

2.病例纳入、排除标准： 病例纳入标准： ①符合中间型地中海贫血西医诊断者；②符合中医肝肾阴虚、精血不足证辩证标准者；③年龄3 ～40 岁。病例排除标准：①伴免疫缺陷，肝、肾及血液系统其他原发性疾病者；②妊娠妇女；③近2 个月内服用其他抗贫血药者。

3.一般资料：11 例中间型地中海贫血患者(5 例α -地中海贫血、6 例β-地中海贫血) 均为就诊于中国人民解放军第303 医院的门诊病例。11 例地中海贫血患者男性7 例，女性5例；患者年龄9 ～26 岁，平均年龄14.73 ±5.87 岁；壮族7 例，汉族4 例。11 例地中海贫血患者的籍贯均为广西籍。

4.观察指标与方法：(1) 主要血液参数的检测：检测冬夏11 例地中海贫血患者血液参数［血红蛋白( Hb) 、红细胞( RBC) 、网织红细胞( Ret) ］的水平。(2) 中医证候量化评分：观察冬夏11 例患者的中医证候( 头晕目眩、爪甲色淡、倦怠乏力、食少纳呆、潮热盗汗、腰酸腿软) 并按课题组制定的《中医证候量化评分表》进行中医证候量化评分［8］。(3) 外周血细胞因子活性的检测：检测冬夏11 例患者血清中造血细胞因子包括干细胞因子( SCF) 、白细胞介素-3( IL -3) 的含量。采用欣博盛公司ELISA 试剂盒检测SCF、IL -3［SCF( EHC153.96) 批号：H140311 -53a；IL-3( EHC005.96) 批号：H140218 -13b］的含量；采用华美生物公司human EPO 试剂盒检测EPO［EPO( 货号： CSB - E04538H) 批号： C0302200354］的含量。(4) 红细胞抗氧化损伤水平的检测：检测冬夏11 例患者红细胞中抗氧化损伤指标包括超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH -Px) 的含量。采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 试剂盒［SOD( A001-3) 批号：20140321； MDA( A003 -1) 批号：20140321； GSH -Px( A005) ；批号：20140321］。(5) 红细胞膜骨架蛋白的检测：检测冬夏11 例患者红细胞膜骨架蛋白α - 收缩蛋白( SPTA1) 、β-收缩蛋白( SPTB) 、带4.1 蛋白( EPB4.1) 的表达差异，用RNeasy Mini Kit( 50) 试剂盒( lot. no. 145039452、145047200) 提取单核细胞中的mRNA，经反转录合成cDNA，以β-actin 为内参；引物有北京赛百盛生物科技有限公司合成，PCR 引 物 序 列 为： β- actin： 上 游 引 物： 5' - GAGACCTTCAACACCCCAGCC - 3'，下 游 引 物： 5' - AATGTCACGCACGATTTCCC-3'； SPTA1： 上游引物：5' - GATCTTGAAGCCAATGTCCA-3'，下游引物：5' -CAACTCCCTCCACTGGTG -3'；SPTB：上游引物：5' -AACCGGGATAAGGTCTTGAGTC-3'，下游引物：5' -GGTGCTTTAGCCATTTATTGTGA -3'；EPB4.1：上游引物：5' -TTATCCACTCACTCACCCTTCC-3'，下游引物：5' - CTCACTAGCAATCTCGGTCTCC - 3'； PCR 产 物 的 检 测：1.2%琼脂糖电泳，溴化乙锭( EB) 染色法检测。检测条件：电压100V，扩增产物在紫外灯下观察，呈红棕色荧光带。

5.统计学方法：采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s) 表示，比较采用两独立样本t 检验。所有的统计检验均采用双侧检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.11 例地中海贫血患者冬夏两季血液参数水平比较：表1 示，冬季(11 月份) 地中海贫血患者Hb 水平显著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) ，RBC、Ret 冬夏两个月份水平差异无统计学意义( P ＞0.05) 。

表1 11 例地中海贫血患者冬夏两季血液参数水平比较(±s)

表1 11 例地中海贫血患者冬夏两季血液参数水平比较(±s)

与夏季比较，* P ＜0.05

时间 n Hb ( g/L) RBC ( ×1012/L) Ret ( %)11 79.17 ±9.72 3.94 ±0.97 5.36 ±2.92冬季 11 87.83 ±12.10*夏季4.03 ±0.85 4.26 ±0.85

2.11 例地中海贫血患者冬夏两季中医证候量化评分水平的比较：表2 示，冬季(11 月份) 地中海贫血患者爪甲色淡、食少纳呆、潮热盗汗的中医证候量化评分显著低于夏季( 7 月份) ( P ＜0.05) ； 头晕目眩、倦怠乏力、腰膝酸软中医证候量化评分冬夏两个月份比较，差异无统计学意义( P ＞0.05) 。

表2 11 例地中海贫血患者冬夏两季中医证候量化评分水平比较(±s)

表2 11 例地中海贫血患者冬夏两季中医证候量化评分水平比较(±s)

与夏季比较，* P ＜0.05

时间 头晕目眩 爪甲色淡 倦怠乏力 食少纳呆 潮热盗汗 腰酸腿软夏季 0.58 ±1.16 3.08 ±2.47 2.09 ±2.34 2.09 ±2.17 4.0 0 ±3.19 0.64 ±1.43冬季 0.50 ±0.52 2.17 ±1.34* 1.64 ±2.20 0.91 ±1.45* 1.18 ±1.47*0.55 ±1.21

3.11 例地中海贫血患者冬夏两季抗氧化损伤水平的比较：表3 示，冬季(11 月份) 红细胞抗氧化损伤指标SOD、GSH-Px 活性显著低于夏季( 7 月份) ( P＜0.01) ，MDA 的活性显著高于夏季( 7 月份) ( P ＜0.01) 。

表3 11 例地中海贫血患者冬夏两季红细胞抗氧化损伤水平(±s)

表3 11 例地中海贫血患者冬夏两季红细胞抗氧化损伤水平(±s)

与夏季比较，* P ＜0.01

时间 n SOD( U/gHb) MDA ( nmol/mg) GSH-Px ( U/gHb)11 7347.42 ±402.29 1.29 ±0.39 192.52 ±7.82冬季 11 5248.37 ±546.11* 2.55 ±0.74* 161.33 ±15.54夏季*

4.11 例地中海贫血患者冬夏两季造血相关细胞因子水平比较：表4 示，冬季(11 月份) 血清造血细胞因子SCF、EPO 水平显著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.01或P ＜0.05) ，IL-3 活性水平冬季( 11 月份) 显著低于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) 。

表4 11 例地中海贫血患者冬夏两季造血相关细胞因子水平比较(±s)

表4 11 例地中海贫血患者冬夏两季造血相关细胞因子水平比较(±s)

与夏季比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

时间 n SCF( pg/ml) IL-3( pg/ml) EPO( mIU/ml)11 56.78 ±8.69 64.11 ±19.39 3.72 ±1.61冬季 11 65.69 ±4.67＊＊ 47.55 ±8.54* 5.31 ±0.89夏季*

5.11 例地中海贫血患者冬夏两季红细胞膜骨架蛋白表达水平比较：表5 示，冬季(11 月份) 地中海贫血患者红细胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表达水平显著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05)，SPTB、EPB4.1 冬夏两个月份的mRNA 的表达水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表5 11 例地中海贫血患者冬夏两季红细胞膜骨架蛋白表达水平比较(±s)

表5 11 例地中海贫血患者冬夏两季红细胞膜骨架蛋白表达水平比较(±s)

Ct 值为荧光检测的域值与基因的表达量呈反比，与夏季比较，* P＜0.05

时间 n SPTA1/β-actin( Ct)SPTB/β-actin( Ct)EPB4.1/β-actin( Ct)11 2.18 ±0.30 1.88 ±0.21 1.82 ±0.19冬季 11 1.95 ±0.32*夏季1.80 ±0.25 1.68 ±0.25

讨 论

地中海贫血( thalassaemia) 也叫珠蛋白生成障碍性贫血，是世界范围内发生率高、危害最大的单基因遗传病。最近研究发现，地中海贫血患者在不同的季节病情的严重程度不同，夏季溶血严重，冬季有所缓解，地中海贫血病情严重程度与季节变化有关。2006年吴志奎等［9］在广西高发区对112 例中间型地中海贫血患者进行了中医证候量化评分、辨证分型，发现中间型地中海贫血患者病情严重程度与季节变化有关，其证候变化特点是：基本证型未变，但临床症状有明显的季节改变( 夏季肝肾阴虚加重： 头晕目眩、潮热盗汗耳鸣、恶热等症状明显加重) 。

2012 年吴志奎课题组在广西高发区在夏季(7 月份) 和冬季(11 月份) 分别收集HbH 病患者31 例和35 例，进一步观察地中海贫血患者证候季节变化的客观规律，研究发现影响地中海贫血患者主要症状的血液参数Hb 水平，冬季组HbH 病患者显著高于夏季，冬季组HbH 病患者大多数中医证候如面色萎黄、爪甲色淡、耳鸣、口咽干燥的量化评分显著低于夏季组，说明患者夏季比冬季病情严重，与冬夏两组患者临床血液参数水平结果一致，进一步证实了HbH 病患者病情严重程度存在季节变化。地中海贫血患者的证候季节变化体现了中医“天人合一”四时阴阳的整体观。地中海贫血患者血液参数的季节改变、溶血贫血严重程度的季节变化，影响患者临床中医证候特异性组合的改变，这种证候的季节变化可能与一些和溶血相关的生物大分子的活性、表达、代谢及红细胞膜结构与功能等相关的生物标志物群的季节性改变有关。有研究显示地中海贫血患者夏季病情严重的机制可能为夏季高温天气下，血容量增加导致内源性血液稀释［10］。但季节性气温变化对地中海贫血患者临床症状影响的程度和血液参数呈现季节性变化的生物学机制到底是什么，目前仍鲜有报道。本研究拟从季节对地中海贫血患者红细胞溶血贫血影响的角度探讨证候季节变化的生物学机制，从一个侧面揭示地中海贫血证候季节变化的生物学机制。

本研究结果显示，影响地中海贫血患者主要症状的血液参数Hb 水平，冬季( 11 月份) 地中海贫血患者Hb 水平显著高于夏季( 7 月份) 。通过对冬夏两组患者中医证候量化评分，发现冬季(11 月份) 地中海贫血患者大多数中医证候如爪甲色淡、食少纳呆、潮热盗汗的量化评分显著低于夏季，说明患者夏季比冬季病情严重，与冬夏两个时间节点主要的临床血液参数Hb 水平结果一致，进一步证实了地中海贫血患者病情严重程度存在季节变化。地中海贫血患者溶血贫血的一个重要原因是红细胞对氧化损伤非常敏感［11］。

MDA 是机体内脂质过氧化损伤的生物标志物［12］。SOD 和GSH -Px 是机体抵抗氧化损伤的重要物质［13，14］。Dhawan 等［13］研究β -地中海贫血纯合子患者抗氧化损伤状态，发现患者SOD 活性与Hb水平呈负相关，说明随着患者病情严重程度加重SOD水平代偿性的升高。Filiz 等［15］研究发现地中海贫血患者SOD 和GSH -Px 活性与正常人相比升高，认为是机体的代偿机制。

本研究发现，冬季( 11 月份) 红细胞抗氧化损伤指标SOD、GSH - Px 活性显著低于夏季( 7 月份) ，MDA 的活性显著高于夏季( 7 月份) ，患者机体由于SOD、GSH-Px 的代偿作用使得夏季( 7 月份) MDA的含量低于冬季(11 月份) ，说明夏季患者病情严重程度比冬季重，激发患者代偿作用清除体内过多的氧化产物。相对过剩的珠蛋白链沉积在红细胞膜上，与红细胞膜结合，可改变膜蛋白的组成，干扰膜骨架蛋白与膜的联结，导致变形能力下降； 诱发膜脂质过氧化反应，导致连接膜骨架的膜蛋白发生氧化损伤，从而造成红细胞膜机械稳定性下降等。研究发现，冬季(11 月份) 地中海贫血患者红细胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表达水平显著高于夏季( 7 月份) ，SPTA1、SPTB、EPB4.1 对维持红细胞结构非常重要，初步推断地中海贫血患者夏季比冬季溶血贫血严重的原因之一可能与两个季节患者红细胞膜骨架蛋白表达不同有关。SCF 是一类刺激早期造血干细胞及祖细胞增殖和定居的造血生长因子，IL -3 为造血调控因子，也为一种炎性因子。EPO 它可以促进红细胞的生成，使血液中红细胞的浓度保持在一个较高的水平。本研究发现冬季( 11 月份) 血清造血细胞因子SCF、EPO 水平显著高于夏季(7 月份) ，IL -3 活性水平冬季(11 月份) 显著低于夏季( 7 月份) ，推断地中海贫血患者夏季比冬季溶血贫血严重的原因之一可能与两个季节患者体内与造血相关细胞因子活性不同有关。

本研究进一步证实了地中海贫血患者病情严重程度存在季节变化的客观规律，并从与地中海贫血患者红细胞溶血贫血的几个侧面初步阐释了地中海贫血患者冬夏两季病情严重程度不同的生物学机制，仍需要开展进一步的临床研究进行验证。

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