小儿氨酚黄那敏颗粒中人工牛黄和体外培育牛黄的研究

张轶华， 姜建国， 孙 婷， 郭永辉

(河北省药品检验研究院，河北 石家庄050011)

小儿氨酚黄那敏颗粒为感冒用药类非处方药药品，适用于缓解儿童普通感冒及流行性感冒引起的发烧、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等症状。现行标准收载在国家药品标准第三册［1］，标准中规定处方为:对乙酰氨基酚125 g、马来酸氯苯那敏0.5 g、人工牛黄5 g 和辅料适量，制成1 000 袋。但在市场上发现有的企业使用体外培育牛黄代替人工牛黄，处方量不变，仍执行该现行标准。人工牛黄由胆酸、猪去氧胆酸、牛胆粉、胆红素、微量元素等原料药物混合配制而成;体外培养的牛黄是国家一类新药，是以牛科动物牛的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成的棕黄色球形物。已有文献报道有关人工牛黄和体外培育牛黄的测定［2-7］，但未见如何区分二者的相关报道。本实验建立了小儿氨酚黄那敏颗粒中人工牛黄和体外培育牛黄中胆酸和猪去氧胆酸的TLC 鉴别方法，并建立了测定二者中胆红素的HPLC 测定方法，该方法简便、快速、准确，专属性强，能更好地控制药品质量。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(美国戴安公司);紫外分析仪(北京六一仪器厂);硅胶GF254板(青岛海洋化工厂);对照品胆酸(批号100078-200414，纯度为100%)，猪去氧胆酸(批号100087-200610，纯度为100%)，胆红素 (批号100077-201206;纯度为98.5%)均购自中国药品生物制品检定研究院;小儿氨酚黄那敏颗粒样品(A 厂，批号20110307;B 厂，批号110102;C 厂，批号110401;D 厂，批号11050329;E 厂，批号066110772;F 厂，批号120504;G 厂，批号1203112;H 厂，批号4110902)，样品为复方制剂，来自8 家不同企业，各1 批，2 家企业(A 和B)使用体外培育牛黄，其余企业均采用人工牛黄。

甲醇为色谱纯(Fisher chemical)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 人工牛黄和体外培育牛黄的TLC 鉴别

2.1.1 薄层色谱条件 薄层板为硅胶G 板(青岛海洋化工厂)，展开剂为异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15 ∶7 ∶5)，点样量为5 μL，展开后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365 nm)下检视。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别称取胆酸和猪去氧胆酸适量，加甲醇制成每1 mL 中含1 mg 的混合对照品溶液。

2.1.3 样品溶液的制备 取本品细粉适量(约相当于人工牛黄20 mg)，加三氯甲烷50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照的制备 除去人工牛黄或体外培育牛黄，模拟处方(分别取各辅料的最大量)按样品溶液的制备方法，制成阴性对照液。

2.1.5 样品测定结果 对照品溶液在紫外灯(365 nm)下检视可见2 个蓝紫色荧光斑点，分离度良好。A 和B 企业采用体外培育牛黄仅检出胆酸，其他企业均检出胆酸和猪去氧胆酸。这与人工牛黄和体外培育牛黄的组成完全吻合。该方法可以快速地区分是否采用体外培育牛黄，TLC 图见图1。

图1 胆酸和猪去氧胆酸的TLC 鉴别图Fig.1 TLC identify picture of cholalic acid and hyodeoxycholic acid

2.2 人工牛黄和体外培育牛黄中胆红素的HPLC法测定

2.2.1 色谱条件 Agilent ZOBAX C18色谱柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相为甲醇-三氯甲烷-0.1%磷酸(88 ∶6 ∶6);检测波长449 nm;进样量10 μL;体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取胆红素对照品10 mg，置100 mL 棕色量瓶中，加三氯甲烷-甲醇-水-盐酸(90 ∶10 ∶0.3 ∶0.03)混合液适量，超声使胆红素溶解并稀释至刻度，摇匀;再精密量取2 mL，置25 mL 棕色量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品5 袋内容物，置100 mL 锥形瓶中，精密加三氯甲烷-甲醇-水-盐酸(90 ∶10 ∶0.3 ∶0.03)混合液25 mL，称定质量，超声提取20 min，取出，迅速冷却至室温，再称定质量，用上述混合液补足减失质量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.2.4 空白溶液的制备 按处方比例，按供试品溶液的制备方法，制备不含人工牛黄或体外培育牛黄的空白样品。

2.2.5 专属性试验 精密量取对照品溶液、供试品溶液及空白样品溶液各10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液与样品溶液主峰的保留时间一致，其他共存组分(对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏)及空白样品溶液均对测定胆红素无干扰。见图2。

2.2.6 线性关系 取“2.2.2”项下对照品贮备液逐级稀释，按照“2.2.1”项色谱条件测定，以各组分峰面积为纵坐标对相应的质量回归绘制标准曲线，y=19.077 +6 697.3x，r =0.999 2，表明在0.01 ～0.1 mg/mL 范围内线性关系良好。

图2 对照品和样品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of reference substance and sample

2.2.7 精密度试验 取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件重复进样5 次，测定峰面积，胆红素峰面积的RSD 为0.8% (n=5)。

2.2.8 重复性试验 取C 厂样品按“2.2.3”项下方法制备供试液，平行制备5 份，进样10 μL 测定，胆红素的含有量平均值为0.028 2 mg/袋，RSD 为0.6% (n=5)。

2.2.9 稳定性试验 取C 厂样品溶液，于避光阴凉处放置，2 h 为稳定。

2.2.10 加样回收率试验 称取已测定含有量的C厂样品(2.5 袋)，平行9 份，分别精密量取胆红素对照品贮备液1.6、2、2.4 mL，回收率均在98.6%以上。

2.2.11 样品测定 对8 个厂家的样品进行胆红素的定量测定，以标准曲线法计算，结果见表1。

表1 测定结果(±s，n=3)Tab.1 Results of bilirubin content (±s，n=3)

表1 测定结果(±s，n=3)Tab.1 Results of bilirubin content (±s，n=3)

厂家 批号 胆红素/(mg/袋)20110307 0.27 ±0.2 B 110102 0.70 ±0.3 C 110401 0.028 ±0 D 11050329 0.029 ±0.4 E 066110772 0.027 ±0.6 F 120504 0.026 ±0.8 G 1203112 0.017 ±0.4 A H 4110902 0.022 ±0

3 讨论

3.1 现行标准中采用显色反应鉴别人工牛黄中的胆酸，由于各企业添加的辅料不同，溶液呈现的颜色也不尽相同，有的蓝紫色明显，但深浅不一，有的则略呈棕黄色，见图3，很难判断样品是否合格，且该鉴别方法无法区分人工牛黄和体外培育牛黄。本实验采用的方法可同时鉴别胆酸和猪去氧胆酸，也可快速区分人工牛黄和体外培育牛黄，以避免不良厂家以人工牛黄冒充价格昂贵的体外培育牛黄。

3.2 人工牛黄和体外培育牛黄中均以胆红素的价格最高，体外培育牛黄中的胆红素量约为人工牛黄中的10 倍以上，因此应对胆红素量进行控制，并规定限度分别为0.027mg/袋和0.27mg/袋。从表1中，可以看出由于现行标准中未对胆红素的量进行控制，存在企业底限投料和少投料的现象。

图3 显色反应的颜色对比图Fig.3 Colour contrast of solution

3.3 人工牛黄和体外培育牛黄的组成不同，但处方量均为5 mg/袋，且执行同一标准，显然不合理，建议分别制订处方和执行标准。

3.4 由于现行标准无法区分人工牛黄和体外培养牛黄，未对胆红素的含有量进行控制，因此市场上存在以次充好，投料不足等现象。本实验拟定的检测方法，操作简便，可快速区分人工牛黄和体外培养牛黄，准确地测定胆红素量，也可对不良厂家提出警示，从而提高药品的内在质量。

［1］ WS-10001-(HD-0214)-2002，国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准:第三册［S］. 2002:53-54.

［2］ 杨洪武，王 峥，辛敏通，等. 薄层扫描法测定人工牛黄及其制剂中胆酸的含量［J］. 中成药，2003，25(4):290-293.

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［5］ 石 岩，孙冬梅，魏 锋，等. 体外培育牛黄中主要胆酸类成分的测定［J］. 药物分析杂志，2013，33 (6):1045-1047.

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