消癌平注射液及其三大类组分抗肿瘤细胞的迁移能力

周婧倩， 钦 松， 马亮亮， 杨 宇， 张 仓， 余伯阳*

(1. 中国药科大学，江苏南京211198;2. 南京圣和药业有限公司，江苏南京210038)

消癌平注射液是由萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima (Roxb.)Wight et Arn. 的干燥藤茎经水提醇沉制成的中药注射剂，临床上常用作肺癌、肝癌、胃癌、食道癌的治疗药物。研究证实消癌平注射液有明显的体外抗肿瘤细胞转移作用［1］，但是尚未见对消癌平注射液的抗肿瘤转移作用的物质基础研究的报道。前期研究表明通关藤药材主要组分为多糖类、酚酸类、甾体苷(元)类［2-4］。本实验采用中压制备色谱分离制备三大类组分并通过模拟肿瘤转移的三个主要步骤:黏附、迁移、侵袭以研究消癌平注射液及其大类组分不同配比下对肿瘤细胞转移的抑制作用及其对抗肿瘤细胞转移的影响能力，为进一步研究消癌平注射液的抗肿瘤作用、探明其有效成分及其作用机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 中压制备色谱MPLC (上海利穗Dr FlashⅡ);Mettler AL104 型分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);细胞培养箱(Thermo 公司);酶标仪(美国Molecular Devices 公司);超净工作台(苏净集团安泰公司);离心机80-2B (上海安亭科学仪器厂制造);倒置显微镜 (日本OLYMPUS XSZ-D2)。

1.2 主要药物及试剂 消癌平注射液(南京圣和药业有限公司提供，批号分别为201209051，201209101，201208310，201203211，201209071，201210221，201207031，201208231，201209271，201209311，201209281，201202271，201207091，201209171，201209151，201208311，201209042，201207231，201006201，201203151)，胎牛血清(GIBCO)，RPMI 1640 培养液(GIBCO)，0.25%胰蛋白酶(南京凯基生物科技发展有限公司);噻唑蓝MTT (美国AMRESCO 公司);纤维连接蛋白FN (美国Calbiochem 公司);小牛血清白蛋白BSA(美国罗氏公司);人工重构基底膜材料Matrigel 胶(美国BD 公司)，结晶紫(南京凯基生物科技发展有限公司);4%多聚甲醛(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.3 细胞 人肺癌细胞系A549，人肝癌细胞系BEL-7402，购于南京凯基生物科技发展有限公司。

2 方法

2.1 样品制备 取消癌平注射液20 mL，经MPLC洗脱程序为A (水)-B (甲醇):1 ～9 min 0%B;9 ～22 min 30%B;22 ～31 min 70% B;31 ～38 min 100% B。大类组分Ⅰ:收集0 ～9 min 的洗脱液;大类组分Ⅱ:收集9 ～22 min 的洗脱液;大类组分Ⅲ:收集22 ～31 min 的洗脱液。各部分样品减压回收溶剂，冷冻干燥后统计并计算各部分得率。根据消癌平注射液中大类组分原固有比例组合得到8组实验药物(见表1)。

2.2 MTT 法检测细胞增殖 取对数生长期的两种细胞按6 ×104个/mL 的密度接种于96 孔板，置37℃、5%CO2培养箱过夜。分别加入生药质量浓度为2、4、8、16、32、64、128、256 mg/mL 的消癌平注射液，阴性对照组及空白组加入等体积的1640 培养液，每组设6 个复孔，置培养箱中孵育48 h 后，每孔加入MTT 100 mL，继续培养4 h 后，加入DSMO 150 mL/孔，用酶标仪测定OD 值，测定波长570 nm，参比波长650 nm。同法测定3 种大类组分IC50。细胞增殖抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

表1 消癌平注射液及其大类组分不同配比药物编号Tab.1 Numbers of different compounds

2.3 细胞黏附能力的检测 调整A549、BEL-7402细胞密度至1 ×106个/mL，与等体积药液混合后，以每孔100 mL 加至已包被纤维连接蛋白并水化的96孔板中，每组设6 个复孔，孵育1.5 h，弃去未黏附的细胞，用PBS 冲洗1 遍，以MTT 法在酶标仪上测定OD 值，测定波长570 nm，参比波长650 nm。黏附抑制率% =(1-ODtreated/ODcontrol)× 100%。

2.4 细胞体外侵袭能力检测 将Transwell 小室的上室面加入50 mL Matrigel 稀释液，放置3 h 后，弃去残液，每孔加入10 mg/mL BSA 50 mL，水化30 min。用1640 培养液调整A549、BEL-7402 细胞密度至1 ×106个/mL，将细胞悬液和药液等体积混合。Transwell 的上室加入180 mL 混合悬液，下室加入完全培养液650 mL，置培养箱培养。20 h后用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，下表面用4%多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染色，使用倒置显微镜进行观察和拍照。小室用10%醋酸100 mL 抽提脱色，在酶标仪上600 nm 测其OD 值。侵袭抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

2.5 细胞迁移能力检测 实验方法与体外侵袭力的检测相同，只是不在聚碳酸脂膜上铺Matrigel胶，置培养箱中12 h 后取出。

2.6 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.0 统计软件分析。

3 结果

3.1 消癌平注射液及其大类组分对A549、BEL-7402 细胞增殖的影响 不同生药质量浓度消癌平注射液处理A549、BEL-7402 细胞48 h 后，MTT 法测定OD 值，并计算IC50，结果显示消癌平注射液对A549、BEL-7402 细胞有明显的抑制作用，同法测定各大类组分IC50(见表2)。

表2 消癌平注射液及大类组分对A549、BEL-7402 细胞增殖影响Tab.2 Effects of Xiaoaiping Injection and its fractions on proliferation of A549 and BEL-7402

3.2 消癌平注射液及其大类组分不同配比组对A549、BEL-7402 细胞黏附能力的影响 生药质量浓度为5 ～20 mg/mL 时，8 组药物均抑制A549、BEL-7402 细胞的黏附，且两种细胞对FN 的黏附抑制率随质量浓度的增加而升高 (见图1)。20 mg/mL 时，消癌平注射液及原固有比例组对A549细胞的最高黏附抑制率分别达到 (46.41 ±3.65)%、 (43.13 ±0.49)%，但3 ～8 号药物对A549 的黏附抑制率均小于25%，与对照组比较均有显著性差异。由两组图表可以看出，在2.5 mg/mL时，大类组分Ⅰ-糖类单用时几乎无效;原固有比例组与对照组实验结果无显著性差异(P ＞0.05)，作用相当，并且作用效果均优于两组分合用及单组分用药。

图1 8 组药物对A549 (A)、BEL-7402 (B)细胞黏附的影响Fig.1 Effects of eight kinds of tested drugs on adhesion of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

3.3 消癌平注射液及其大类组分不同配比对A549、BEL-7402 细胞体外侵袭力的影响 图2 为用倒置显微镜拍摄的经结晶紫染色的侵袭到Transwell 小室底部的A549、BEL-7402 细胞，随着药物质量浓度的增高，侵袭过基底膜的细胞数逐渐减少，穿过膜的细胞数量直观的体现了1 ～8 号药物在生药质量浓度分别为2.5、5、10 mg/mL 时对A549、BEL-7402 细胞侵袭的抑制能力。10 mg/mL时，8 组药物对A549 细胞的抑制率分别为80.76%、82.22%、55.65%、57.91%、59.70%、35.40%、45.49%、46.24%;对BEL-7402 细胞的抑制率分别为:88.68%、87.97%、62.83%、65.54%、69.57%、41.49%、46.23%、42.25%。实验数据显示，高质量浓度时，8 组药物对两种细胞的侵袭具有不同程度的抑制作用:原固有配比组高于两两配比组，更高于单组分组;低质量浓度时，各组药物之间无显著差异，随着药物质量浓度的增加两种细胞的各组数据与对照组比较有统计学意义(P ＜0.01)。

图2 8 组药物对A549 (A)、BEL-7402 (B)细胞侵袭的影响Fig.2 Effects of eight kinds of tested drugs on cell invasion of A549 cells and BEL-7402 cells

3.4 消癌平注射液及其大类组分不同配比对A549、BEL-7402 细胞运动迁移的影响 8 组药物对A549、BEL-7402 细胞的运动趋化的抑制力同样具有剂量依赖性(见图3)，在生药质量浓度为15 mg/mL 时，两种细胞的最高迁移抑制率大于50%。对照组与原固有比例组无显著差异，其它各组与对照组比较具有统计学意义(P ＜0.01)。

图3 8 组药物对A549 (A)、BEL-7402 (B)细胞迁移的影响Fig.3 Effects of eight kinds of tested drugs on migration of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

4 结论

消癌平注射液化学成分复杂，具有广泛的药理活性，特别是其抗肿瘤作用较为明显，且不良反应轻微［5-7］。

本研究从20 批消癌平注射液的不同梯度洗脱液中分离得到三大类化学组分，经HPLC-UV/ELSD 检测大类组分Ⅰ、大类组分Ⅱ、大类组分Ⅲ为:糖类、酚酸类、甾体类［8-10］，各组得率分别为(59.68 ±1.61)%、(16.93 ±1.53)%、 (14.90 ±0.93)%，统计消癌平注射液中大类组分原固有配比为(59.68 ±0.62)∶(16.93 ±0.59)∶(4.90 ±0.36)，20 批制备样品平均总得率为91.50 ±1.62%，说明制备样品方法的稳定性良好。

研究证实消癌平注射液及三大类组分能不同程度抑制人肺癌A549 细胞、人肝癌BEL-7402 细胞的增殖。本研究通过黏附［11］、迁移、侵袭［12-13］3个方面探索消癌平注射液及其大类组分不同配比组药物(共计8 组药物)可能的抗肿瘤转移机制，实验结果显示不同药物组对抗肿瘤转移具有剂量与时间相关性，随着剂量的增加，抑制率增大。综上所述，8 组药物中消癌平注射液组与3 种组分依据原固有比例配比组(2 号药物)实验结果无显著性差异(P ＞0.05)，抑制作用相当，抑制作用优于两种药物配比组，更优于单组分组。因此，我们根据中效原理［14-15］中的联合作用公式设计了一系列实验以研究三大类组分间是否存在协同作用，已有实验结果显示消癌平注射液中的三大类组分中两种组分联合用药时的合并指数CI 均小于1，初步说明消癌平注射液中的三大类组分在抗肿瘤作用方面具有协同作用。

本研究结果也体现了中药多途径、多靶点整合调节的作用特点。消癌平及大类组分不同配比组在肿瘤转移过程中的细胞黏附、侵袭以及抗迁移均表现出抑制作用，其中抗侵袭作用的最高抑制率大于80%，推测抗侵袭作用是消癌平注射液发挥抗肿瘤细胞转移的关键步骤，具体机制有待进一步研究。

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