基于1 H-NMR 谱的独一味代谢产物基础研究

潘 正， 毛 庆， 江 生， 范 刚， 张 艺

(1. 成都中医药大学民族药学院，四川成都611130;2. 重庆市食品药品检验所，重庆401121)

达布巴系藏医药学临床常用药材，别名达巴巴、吉布孜、达干木等，唇形科独一味属植物独一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 是其来源之一;独一味分布于不丹、印度、尼泊尔和中国的西藏、青海、甘肃、云南等地，生长于海拔3 000 m以上的石质高山草甸、河滩地，是藏、蒙古、纳西等少数民族常用草药［1-2］。独一味胶囊主要用于病人的切口疼痛、出血及手术后，但由于采挖地下部分破坏草地，近年来禁止采挖全草，独一味为植株的干燥地上部分，以保护高寒草地的生态环境［3］。独一味止血潜在市场需求还在急剧扩大，野生资源品质面临更大的压力。

独一味主要含有黄酮、环烯醚萜、苯乙醇苷、挥发油及其他类成分［4-6］，上述成分中，环烯醚萜类、黄酮类和苯乙醇苷是独一味的主要活性成分［7-9］。近年来，针对上述三类成分，国内学者进行了多种该分析方法的研究，分析方法集中于HPLC、HPLC-PAD、HPLC-PAD-MS 等［10-14］，但上述方法有一定局限性，样品测试时间长，不能全面反映药材或制剂的品质。

1H-NMR 技术的代谢物组学研究天然药物的品种鉴定、质量评价、化学分类学及产地溯源等研究领域具有多方面的优势。该方法单次测量就能同时检测分析药用植物中的多个主要组成成分;样品预处理步骤简单;测定快速准确;专属性强。本实验采用基于氢核磁共振的代谢物组学技术，建立了独一味的整体代谢指纹图谱，该研究对于独一味的鉴定、产地判别、质量控制与评价、品种鉴别及其临床合理利用等都将有重要的指导作用。

1 仪器与试药

Varian Mercury Plus 400 MHz 核磁共振波谱仪(美国Varian 公司，第三军医大学-重庆化医集团控股公司联合实验室);Sartorius BP221S 电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-300B 型超声波清洗器(郑州巩义市英峪仪器厂);氘代甲 醇 (CD3OD，99.8%)、氘 代 三 氯 甲 烷(CDCl3，99.8%)、重水 (D2O，99.9%)和氘代丙酮(acetone-d6，99.9%)均购自北京京云重轻科技有限公司;8-O-乙酰山栀苷甲酯 (纯度98.63%)、毛蕊花糖苷(纯度为98.12%)均为本实验室自制，经HPLC 测试，面积归一化法计算纯度，UV、NMR 光谱测试确认其结构。

独一味药材均采于2012 年7 月—8 月，样品由甘南百草生物科技开发有限公司采集，由张艺研究员鉴定为唇形科独一味属植物独一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 仪器条件 供试液在25 ℃，35%湿度环境下Varian 400 兆NMR 仪上测定。质子观察频率400.64 MHz，采用弛豫时间编辑 (Carr. Purcell-Meiboom. Gill)脉冲序列，脉冲延迟时间 (d1)为1 s，谱线宽度(lb) =0.3;谱宽6 kHz，为了增大信噪比，取128 次的扫描次数，FID 信号采集时间(at) =2.78;FID 转换所需点数为65536;调用水峰压制序列(Presat)压制残余水峰，总测定时间为11 min 22 s。在25 ℃时取一定量供试液溶解于0.5 mL 氘代甲醇溶剂中，TMS 为内标，测定独一味样品的1H-NMR 图谱。

2.2 供试溶液的制备 精密称取干燥的甘肃玛曲马场产独一味粉末约100.0 mg，置于2 mL EP 管中，分别加入0.8 mL CD3OD，超声提取30 min，离心(10 000 r/min);取上清液以0.22 μm 微孔滤膜过滤，加入0.6 mL 至标准的5 mm 核磁管中，备用。

2.31H-NMR 谱图处理 核磁图谱采用MestReNova (Version:6.1.0-6224)傅立叶变换处理，以TSP 的化学位移为标准对谱图进行校正并进行相位、基线调整处理。将δ 0.00 ～8.00 范围按照0.04 为最小间隔积分，对数据进行归一化处理。再对数据进行ASCⅡ标准化，除去因交叉弛豫引起峰型变宽的残余水峰，最终得到186 段数据，代表186 个变量进行相似度分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 精密称取同一批甘肃玛曲马场供试品，按照“2.2”项制备供试样品液。1H-NMR 波谱连续测定6 次，按“2.3”项下所述方法处理图谱，得到6 组积分值数据，以第一组数据为共有模式，通过Excel 软件计算数据之间的夹角余弦值，分别为1.000、0.996、0.995、0.996、0.999 和0.997，均大于0.995，实验结果显示仪器测量精密度良好。

2.4.2 重复性 精密称取同一批药材粉末6 份，每份100.0 mg，按照“2.2”项制备供试样品液。再按上述方法分别进行1H-NMR 测定和数据处理，按“2.3”项处理图谱，得到6 组积分值数据，以第一组数据为共有模式，通过Excel 软件计算数据之间的夹角余弦值，分别为 1.000、0.996、0.998、0.995、0.996 和0.997，均在0.995 以上，说明样品制备方法具有很好的重复性。

2.4.3 稳定性 精密称取同一批甘肃玛曲马场供试品，按照“2.2”项制备供试样品液。分别在0、4、8、12、16、20 h 连续进行1H-NMR 测定6 次，按“2.3”项处理图谱，得到6 组积分值数据，以第1 组数据为共有模式，通过Excel 软件计算数据之间的夹角余弦值，分别为 1.000、0.995、0.997、0.997、0.999、099 5 和0.997，均大于0.995，结果显示在常温实验条件下20 h 内测定供试样品溶液稳定性良好。

2.5 图谱信号归属 采用“加标定性试验”、以及与文献［5，7，9，13］数据比对的方法进行独一味供试品1H-NMR 指纹图谱的信号归属。

3 讨论

3.1 样品提取溶剂的考察 取同一批药材4 份(甘肃玛曲马场)，分别以CDCl3、CD3OD-D2O(0.7 ∶0.3，V/V)、acetone-d6和CD3OD 为提取溶剂制备供试品溶液，进行1H-NMR 测定，观察每个溶剂体系的提取效率，结果见图1。

图1 不同提取溶剂的1H-NMR 测定结果比较Fig.1 1H-NMR Spectra of different solvent extractions

结果表明，CDCl3和acetone-d6能提取出更多的低极性代谢物，如脂肪酸类成分，但是二者对次生代谢产物的提取效率却很低。CD3OD 和CD3OD-D2O 体系都能提取出更多的次生代谢产物，CD3OD-D2O 能提取出更多的糖类成分，但峰信号在δ3.0 ～4.0 之间重叠严重，CD3OD 峰信号整体重叠较CD3OD-D2O 轻，但信号强度较CD3OD-D2O 弱，但可以通过增加样品的质量提高提取溶液浓度消除信号较弱的缺点，综合各种因素考虑，最终选择CD3OD 为样品溶液制备的提取溶剂。

3.2 药材提取物1H-NMR 谱的代谢物鉴定 以甘肃玛曲产独一味地上部分为研究对象，进行1HNMR 信号归属及代谢物鉴定。从1H-NMR 谱图中可以获取样品中不同物质的化学位移、耦合常数、裂分情况以及谱峰面积比例等相关信息，其中根据化学位移可初步判断该质子所处的化学基团种类，以及“加对照品定性试验”和对比文献数据，帮助物质结构的确定。如图2 所示，样品氢谱显示δ7.32 (1H，s)为与羰基共轭的烯氢质子，δ5.56(1H，d，J=4.0 Hz)为与两个氧相连的次甲基质子，与对照品8-O-乙酰山栀苷甲酯的NMR 图谱吻合，可以构建8-O-乙酰山栀苷甲酯的代谢物指纹峰。

最终，从独一味地上部分提取物中共鉴定出10 个化合物(表1)，5 个环烯醚萜苷类化合物，3个苯丙素类化合物和2 个糖类化合物。其中:环烯醚萜苷类化合物为山栀苷甲酯，8-O-乙酰山栀苷甲酯，6-O-乙酰山栀苷甲酯，胡麻属苷，Phlorigidoside C;苯丙素类化合物为木犀草苷，连翘酯苷B和毛蕊花糖苷;两种糖类化合物为α-葡萄糖和β-葡萄糖。

表1 独一味代谢产物1H-NMR 信号归属特征信号峰及耦合常数Tab.1 1H-NMR chemical shifts and coupling constant of L. rotate metabolites

独一味地上部分的一维1H-NMR 谱见图2。

图2 独一味氘代甲醇提取物1H-NMR 指纹图谱中代谢产物信号归属Fig.2 Representative 1H-NMR spectra (CD3OD)of Lamiophlomis rotate methanol extract and metabolites are classified

4 结论

独一味中的黄酮类成分和苯乙醇苷类成分，全波长紫外吸收图谱比较接近，紫外分光光度法很难准确测定出总黄酮类或苯乙醇苷类成分，HPLC 或HPLC-MS 等方法可以通过化合物的保留时间和相应面积，对样品中的两类成分定性定量，但色谱柱品牌不同，仪器或实验室条件不同，结果难免产生偏差。实验基于1H-NMR 谱的独一味地上部分测试，可检测分析独一味中10 个主要组成成分。同时供试品溶液制备简单，样品测定快速，1H-NMR方法具有很好的普适性、耐用性和重复性。

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