芪七连胶囊对自发性高血压大鼠血管保护作用的实验研究

罗 远， 岳桂华， 赵晓芳， 陈 壮， 叶 雲

(1. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530011;2. 广西中医药大学，广西 南宁530001;3. 中国人民解放军第303 医院，广西 南宁530021)

芪七连胶囊是广西中医药大学附属瑞康医院开发的医院院内制剂，由黄芪、黄连、三七、黄柏、栀子、杜仲、钩藤等七味药组成，具有益气活血解毒之功效。临床上用于由高血压引起的眩晕、烦躁、头痛、胸闷、心悸、手足麻木、乏力等症。前期的临床观察［1-3］发现芪七连胶囊不仅具有降低血压，而且还可以有效改善患者临床症状，改善焦虑抑郁症状，提高生存质量等作用。本研究观察芪七连胶囊保护自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats ，SHR)血管的保护作用，为临床进一步应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 取雄性SHR 50 只和正常血压wistar-kyoto (WKY)大鼠10 只，体质量(200 ±10)g，12 周龄，SHR 购自北京维通利华实验动物技术有限公司 (许可证号SCXK (京)2006 ～0009)。WKY 组为正常对照，购自广西医科大学动物实验中心(合格证号SCXK (桂)2006-0003)。

1.2 药品与试剂 芪七连胶囊(广西中医药大学附属瑞康医院民族医药研发基地生产，批号2013062101);氯沙坦(杭州默沙东制药有限公司，批号120028);内皮素(ET )试剂盒(产品编号CSB-E06979r)、血管紧张素(AngⅡ)试剂盒(CSB-E04494r) (武汉华美科技有限公司生产);NO 试剂盒 (南京建成生物工程研究所，批号20110916)。逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒(天根试剂公司)，bFGF 正向引物:5’-CACCCTATCCCTTCACAGC-3’，反向引物:5’-CACCTTCCGACCAGCAAC-3’，PCR 产物片段为112 bp。参照基因GAPDH，正向引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCACT -3’，反向引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’，PCR 产物片段为452 bp，以上引物由上海申友公司合成。

1.3 仪器 MK3 酶标仪(美国Thermo 生产);BP-6 型大鼠无创血压测试仪(成都泰盟科技有限公司生产);LKB-V 超薄切片机 (瑞士LKB 公司);H-500 型透射电子显微镜(日本日立公司);PAC-300 低压电泳仪(美国Bio-Rad);PTC 200 多通道PCR 扩增仪(美国MJ);1575 洗板机(美国BIO-RAD 生产)，5810R 型低温高速离心机(德国Eppendorf);凝胶成像分析系统(GELDOC Xr)。

2 实验方法

2.1 药物制备 取芪七连胶囊内容物适量，加入蒸馏水制成适宜质量浓度的混悬液(临用摇匀)。

2.2 动物分组及给药 将SHR 随机分为模型组，阳性药对照组，芪七连胶囊低、中、高剂量组，每组10 只，另取10 只健康WKY 大鼠作为正常对照。给药剂量为:氯沙坦组(4 mg/kg)，芪七连胶囊3 个剂量(0.3、0.6、1.2g/kg，依据人与大鼠体表面积剂量转换，分别相当于人临床用药的0.5、1、2 倍)、模型对照组、正常对照组灌服等容积蒸馏水。每日1 次，每次给药量为10 mL/kg，连续给药6 周。

2.3 大鼠血压测量 每周用BP-6 无创尾动脉血压测量分析系统测量清醒状态下大鼠尾动脉血压。

2.4 样品采集与检测 给药6 周后，上述各组动物以戊巴比妥30 mg/kg 腹腔注射麻醉，迅速从腹主总动脉取血，并剪取腹主动脉。血浆4 ℃离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，置-20 ℃保存。腹主动脉分3 份，一份迅速置于1.5 mL 离心管中加入Trizol 1 mL，-80 ℃保存;一份放入预冷的2.5%戊二醛固定备用，另外一份置于10%的福尔马林中固定。全部取样结束后，用放免法检测血清中NO、ET-1 和AngⅡ水平，均严格按各试剂说明书操作。

2.5 主动脉病理观察及评分标准 取经10%福尔马林固定的主动脉，脱水，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，HE 常规染色。光镜下对每张切片全视野观察病理变化并评分，观察动脉血管内皮细胞层损伤、中膜损伤、外膜增生3 个指标，分为正常、轻度、中度、重度4 个等级，每个等级的评分分别为0、1、2、3 分。

2.6 血管内皮细胞病变情况 取经2.5%戊二醛固定的腹主动脉，后用PBS 漂洗3 次，再放入1%锇酸固定2 h，再用PBS 漂洗3 次，经过脱水，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察血管内皮细胞超微结构病理变化情况。

2.7 PCR 法检测bFGF mRNA 表达 取Trizol 液中保存的腹主动脉，按试剂盒说明进行样品总RNA的提取与纯化，以PCR 仪逆转录后，RT-PCR 仪进行扩增，按照下列反应条件进行:预变性94 ℃5 min;94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，进行35 个循环，72 ℃延伸10 min，2% 琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭显色。扩增产物条带用凝胶成像分析系统图像分析软件作光密度测定，用目的基因条带与GAPDH 条带光密度的比值作为目的基因mRNA 的相对水平。

2.8 统计学处理 应用SPSS 17.0 统计软件分析处理数据，所有数据以均数±标准差(±s)表示，两组数据间的比较采用t 检验，动脉病变评分采用Mann-whitney 秩和检验，P ＜0.05 为有显著统计学差异。

3 结果

3.1 对SHR 血压的影响 与治疗前比较，给药后6 周，芪七连胶囊高、中、低剂量组均对SHR 的收缩压(SP)和舒张压血压(DP)均明显降低(P ＜0.05 ～0.01)，氯沙坦组在治疗后对SP 和DP也有显著的降低作用(P ＜0 .01);与氯沙坦组比较，芪七连胶囊组无优效性，见表1。

表1 芪七连胶囊对SHR 血压的影响(1 mmHg =0.133 kPa，±s，n=10)Tab.1 Effects of Qiqilian Capsules on blood pressure of SHR (1 mmHg=0.133 kPa，±s，n=10)

表1 芪七连胶囊对SHR 血压的影响(1 mmHg =0.133 kPa，±s，n=10)Tab.1 Effects of Qiqilian Capsules on blood pressure of SHR (1 mmHg=0.133 kPa，±s，n=10)

注:与治疗前比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别 剂量 治疗前/mmHg 治疗6 周后/mmHg正常对照组模型对照组——氯沙坦组4 mg·kg -1芪七连胶囊组0.3 g·kg -1 0.6 g·kg -1 1.2 g·kg -1 SP 109.83 ±7.26 107.12 ±6.42 DP 78.64 ±5.50 79.02 ±3.46 SP 157.05 ±9.44 188.33 ±13.70▲▲DP 114.71 ±6.18 134.60 ±9.53▲▲SP 155.34 ±11.12 117.95 ±7.43▲▲＊＊DP 115.21 ±7.59 83.39 ±5.09▲▲＊＊SP 156.01 ±11.97 124.19 ±9.15▲▲＊＊DP 115.26 ±7.04 96.92 ±7.53▲＊＊SP 156.87 ±11.36 119.04 ±8.75▲▲＊＊DP 114.05 ±6.65 89.44 ±4.26▲▲＊＊SP 154.23 ±10.77 119.31 ±7.61▲▲＊＊DP 114.82 ±7.02 86.16 ±6.57▲▲＊＊

3.2 芪七连胶囊对SHR 血清中NO、ET、AngⅡ水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组SHR 血浆ET、AngⅡ水平较正常对照组组明显升高(P ＜0.01)，NO 水平较正常对照组明显降低(P ＜0.01)。芪七连胶囊各治疗组对SHR 血浆ET和AngⅡ水平较模型对照组有所降低，NO 水平有所升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表2。

表2 芪七连胶囊对SHR 血清中ET、Ang Ⅱ、NO 水平的影响(±s，n=10)Tab.2 Effects of Qiqilian Capsules on ET，Ang Ⅱ，NO in serum with SHR (±s，n=10)

表2 芪七连胶囊对SHR 血清中ET、Ang Ⅱ、NO 水平的影响(±s，n=10)Tab.2 Effects of Qiqilian Capsules on ET，Ang Ⅱ，NO in serum with SHR (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别 剂量 ET/(pg·mL -1) AngⅡ/(pg·mL -1) NO/(μmol·L -1)46.32 ±9.45 437.08 ±37.11 107.37 ±20.41模型对照组 — 83.15 ±17.33▲▲ 771.12 ±48.59▲▲ 38.83 ±8.14▲▲氯沙坦组 4 mg·kg -1 48.71 ±11.35＊＊ 499.19 ±23.41▲＊＊ 80.57 ±14.02▲▲＊＊芪七连胶囊组 0.3 g·kg -1 67.02 ±11.80▲▲＊＊ 631.16 ±39.07▲▲＊＊ 56.56 ±19.64▲▲＊＊芪七连胶囊组 0.6 g·kg -1 54.15 ±12.85▲＊＊ 581.42 ±41.26▲▲＊＊ 74.57 ±14.67▲▲＊＊芪七连胶囊组 1.2 g·kg -1 50.66 ±14.02＊＊ 522.23 ±38.38▲＊＊ 86.07 ±17.69▲＊＊正常对照组 —

3.3 对主动脉组织病变的影响 与模型对照组比较，各治疗组能有效的改善动脉组织的病变情况，芪七连胶囊低、中、高剂量组能有效改善动脉内皮细胞层、中膜层损伤及外膜层增生情况(P ＜0.01或P ＜0.05)，并在给药量0.3 ～1.2 g/kg 呈量-效关系，见表3。

3.4 对主动脉血管内皮细胞超微结构病理的变化的影响 在透射电镜下观察，正常对照组血管内皮细胞肌膜清晰，细胞内可见大量密斑，细胞核形态较规则，线粒体形态正常，胞浆内可见少量内质网(见图1-A);模型对照组血管内皮细胞明显肿胀，膜大多尚完整，胞内可见大量密斑、密体，细胞核不规则，线粒体空泡变(见图1-B);氯沙坦组可见肌膜清晰，细胞核较规则，线粒体形态正常(见图1-C);芪七连胶囊低剂量组胞内可见大量密斑、密体，细胞核较规则，线粒体肿胀、胞内出现大量空泡(见图1-D);芪七连胶囊中剂量组膜较完整，细胞核较规则，线粒体形态多数规则(见图1-E);芪七连胶囊高剂量组部分血管内皮细胞轻度肿胀，细胞排列整齐，膜完整，多突起，胞膜下密斑清晰可见，细胞核形态较规则，线粒体结构正常(见图1-F)。

表3 芪七连胶囊对SHR 主动脉组织病变的的影响(±s，n=10)Tab.3 Effects of Qiqilian Capsules on pathological changes in aortic wall with SHR (±s，n=10)

表3 芪七连胶囊对SHR 主动脉组织病变的的影响(±s，n=10)Tab.3 Effects of Qiqilian Capsules on pathological changes in aortic wall with SHR (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别 剂量 内皮细胞层损伤 中膜层损伤 外膜层增生正常对照组 —0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型对照组 — 2.78±0.43▲▲ 2.13±0.35▲▲ 1.62±0.26▲▲氯沙坦组 4 mg·kg -1 0.99±0.22＊＊ 0.79±0.17＊＊ 0.34±0.11＊＊芪七连胶囊组0.3 g·kg -1 1.30±0.31▲* 1.13±0.40▲* 0.46±0.09*芪七连胶囊组0.6 g·kg -1 0.97±0.27▲＊＊ 0.70±0.33＊＊ 0.35±0.13＊＊芪七连胶囊组1.2 g·kg -1 0.67±0.16＊＊ 0.44±0.24＊＊ 0.30±0.16＊＊

图1 芪七连胶囊对SHR 主动脉超微结构的影响(×4800)Fig.1 Effects of Qiqilian Capsules on aortic Ultrastructures features in SHR

3.5 RT-PCR 半定量检测bFGF mRNA 的表达 与模型对照组相比，芪七连胶囊各治疗组、氯沙坦组中SHR 主动脉血管中的bFGF mRNA 的相对表达量不同程度的降低，有显著性差异(P ＜0.01)，表明芪七连胶囊可以有效的抑制动脉血管中bFGF 的表达;与氯沙坦组比较，芪七连胶囊组无优效性。见表4，图2。

表4 芪七连胶囊对SHR 动脉中bFGF mRNA 表达量的影响Tab.4 Effects of Qiqilian Capsules on mRNA expression of aortic bFGF in SHR

图2 bFGF mRNA 电泳图像Fig.2 Image of different bFGF mRNA expression levels

4 讨论

血管内皮是血管壁和血液之间的屏障，具有维持血管壁的光滑和血流通畅，介导炎症与免疫反应，参与调节抗凝系统，调节血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的生长及增殖等功能。血管内皮功能障碍被认为是高血压的病因，其功能混乱是高血压病始动环节和早期表现的重要特征［4］，大量的研究表明，高血压患者几乎都伴随着血管内皮功能的减退，血管内皮损伤的程度可以反映出高血压患者病情的严重程度［5-7］，因此，阻止或逆转高血压患者血管内皮病变是防治高血压病情发展的关键。光镜和电镜观察动脉组织的病变情况，可以直观的反应芪七连胶囊保护SHR的血管内皮作用。本实验通过光镜和电镜观察芪七连胶囊对SHR 的动脉血管组织的的病变情况。采用秩和检验法比较各组间SHR 动脉血管组织的情况，与模型组比较，芪七连胶囊能明显改善SHR主动脉内皮细胞部分脱落，内膜不光滑，有血细胞黏附聚集，中膜弹性纤维变直、减少、断裂，外膜增生等情况。通过电镜观察血管内皮细胞，结果表明芪七连胶囊能够能够明显改善内皮细胞肿胀，细胞核不规则，线粒体空泡变等病理情况，表明芪七连胶囊具有保护血管的作用。

血管内皮对高血压病的影响主要是通过分泌多种血管活性物质，达到调节血管壁的舒缩和平滑肌细胞的增殖、迁移等作用，这些活性物质主要包括NO、ET、AngⅡ、前列环素等。NO 是内皮细胞释放的主要舒血管物质，它的生成和分泌的正常是血管内皮功能正常的重要标志，它不仅维持血管张力的恒定和调节血压的稳定，还通过抑制细胞有丝分裂VSMC 的增殖和迁移，参与血管重塑，一旦NO合成和利用发生障碍，血管内皮长期处于促炎症、促血栓和促凝状态，进而导致血管结构的改变和血管平滑肌的肥大。AngⅡ血管内皮细胞分泌细胞因子，它可促使血管平滑肌发生剧烈收缩，进而引起血管外周阻力增加和动脉压升高。同时，AngⅡ还可以作用于交感神经末梢上及中枢神经系统的血管紧张素受体，释放去甲肾上腺素及加强交感缩血管紧张使外周阻力增大，血压升高。因此，抑制AngⅡ活性是治疗高血压及逆转血管重构的基础。此外，局部组织产生的AngⅡ可以促进血管ET-1的合成和分泌，又可以抑制NO 的合成和分泌，而AngⅡ与NO 之间的活性不平衡是诸多疾病发生的根源。ET 是由血管内皮分泌的缩血管多肽，是目前已知缩血管作用最强最持久的细胞因子，同时，ET 可以促进c-myc、c-fos 等原癌基因表达，使得血管内皮细胞增殖，血管壁增厚、管腔变得狭窄［8，9］。当血管内皮损伤时，血管内皮ET 表达增强，ET 水平升高。因此，测定血浆中 NO、AngⅡ、ET 水平能够可靠地反映血管内皮的功能状态和损伤程度［10-12］，有效的反应芪七连胶囊对SHR 血管内皮保护作用的部分机制。本实验结果显示，芪七连胶囊可以抑制Ang Ⅱ、ET 的活性(P ＜0.01 或P ＜0.05)，上调NO 的的活性(P ＜0.01)，这是可能芪七连胶囊降血压的部分机制之一，也可能是其保护血管作用的部分机制。

在高血压的发生发展中，很多生长因子的异常分泌都会引起VSMC 的表型转换、增殖及迁移，而bFGF 作为VSMC 的最强的有丝分裂原，其作用更是尤为突出。正常情况下合成bFGF 的主要血管壁细胞包括VSMC 和内皮细胞，但内皮细胞受损，浸润的巨噬细胞和T 淋巴细胞也能合成bFGF。因此，血管内皮受损，将会导致bFGF 的异常表达［13-15］。此外，bFGF 可诱导血管壁NO 合酶的活性，促进NO 的产生，舒张血管，从而对血压进行调节，拮抗高血压的形成。因此，测定bFGF 的表达量，可以直接反应药物对高血压病情的改善程度。本实验结果显示，芪七连胶囊有效的抑制SHR 动脉血管中bFGF 的表达(P ＜0.01)。

综上所述，芪七连胶囊对SHR 血管具有较好降血压及血管保护作用，其作用的机制可能是通过下调血清中ET、AngⅡ的活性，增强血清中NO 的活性，下调动脉血管中bFGF mRNA 的的表达有关，其是否通过其他的途径，还需进一步的研究。

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