效应面法优化染料木素磷脂复合物制备工艺

尹胭脂， 熊 阳 ， 吴雪莉， 祝露佳， 金 琪， 王星辉

(1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208;2. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州310053)

染料木素(genistein)亦称金雀异黄素，主要是从大豆、葛根、槐花、染料木等豆科植物中提取出来的活性成分，是大豆异黄酮类物质中活性最高的单一成分。它具有多种生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等，广泛应于制药、保健品等领域，是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用具有广泛的应用前景。然而，染料木素的水溶性和脂溶性均较差，溶出速度慢;在胃肠道属于被动扩散，油水分配系数小，肠渗透性差，多种因素导致其口服生物利用度很低［1-3］。

研究发现磷脂与某些药物形成复合物后，可改善药物的性质。如改变药物的溶解性能和溶出速度，增加其表观油水分配系数，增强在胃肠道中的吸收，提高生物利用度;增强药物的药理作用及疗效;延长药物的作用时间;降低药物的毒副作用;减小胃肠道刺激性等［4-5］。因此，为提高染料木素的生物利用度，本实验将其制备成磷脂复合物。

星点设计 (central composite rotatable design，CCRD)是近几年来国外药学工作者常用的集数学和统计方法于一体的实验设计方法，应用已经成熟，与国内经常采用的均匀设计和正交设计相比具有精确度高、预测性好、简便等优点［6-7］。因此，本试验采取了星点设计结合效应面法优化染料木素磷脂复合物的制备工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 JA1003 电子天平(上海精科有限公司);电子分析天平 (奥豪斯仪器有限公司CP213);恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器制造厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);离心沉淀机(上海手术器械厂80-2);紫外分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 药品与试剂 染料木素和染料木素对照品(南京春秋生物工程有限公司;纯度98%，批号ZL20120227);大豆磷脂(上海太伟药业有限公司);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 染料木素磷脂复合物制备方法 利用染料木素不溶于二氯甲烷，而磷脂和染料木素磷脂复合物均易溶于二氯甲烷且不易被破坏的特性，本实验采用二氯甲烷溶解反应物分离未复合的染料木素。将一定量的染料木素和磷脂在一定条件下反应后，减压除去反应溶剂，残余物加入二氯甲烷，充分溶解磷脂及复合物，4 000 r/min 离心15 min，取上清液，去除有机溶剂后真空低温干燥，即得染料木素磷脂复合物，为黄色略带黏性的粉末。离心后所得的沉淀用95%乙醇溶解后，采用紫外可见光谱仪对未复合的染料木素进行测定。

2.2 复合率的计算方法 由于染料木素几乎不溶于二氯甲烷，而磷脂以及磷脂复合物易溶于二氯甲烷，将制备好的磷脂复合物加入适量二氯甲烷，磷脂复合物及多余的磷脂溶于其中，离心后的沉淀即为未复合的染料木素。通过公式(1)可计算出染料木素与磷脂的复合百分率(S):

其中M1为染料木素的初始投药量;M2为沉淀量。

2.3 染料木素的UV 测定方法

2.3.1 紫外吸收波长的确定 精密称取10 mg 染料木素对照品，无水乙醇定容至100 mL，即得100.0 μg/mL 的贮备液，将贮备液配制成4.0 μg/mL溶液，于200 ～400 nm 进行全波长扫描。结果显示，其最大吸收波长位于262 nm。

2.3.2 标准曲线的建立 将染料木素贮备液配制成质量浓度为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL 的溶液，以乙醇为空白，在262 nm 波长下测吸光度。建立吸光度A 与质量浓度C 的标准曲线，得标准曲线为Y=0.006 9X-0.003，r =0.999 7。由此可见，染料木素在2.0 ～6.0 μg/mL 范围内，吸光度与质量浓度的线性关系良好。

2.3.3 精密度实验 取5.0 μg/mL 的对照品溶液，1 d 内连续测定6 次吸光度，结果RSD =0.70%，说明精密度良好。

2.3.4 稳定性实验 取5.0 μg/mL 的对照品溶液，分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 测定染料木素含有量。结果其RSD 为0.21%，表明染料木素在3h 内保持稳定。

2.3.5 回收率实验 取已知含有量的样品溶液6份(3.8 μg/mL)，精密加入染料木素对照品(每1 mL加入相当于4.0 μg 染料木素的贮备液)，在262 nm 波长下测定吸光度。根据实测值与理论值的比值计算回收率，结果该方法的平均回收率为(98.3 ±1.36)%，RSD 为1.49%。

2.4 单因素影响实验

2.4.1 反应溶剂的选择 设定磷脂与染料木素的投料比(m/m)为2 ∶1，反应温度为50 ℃，反应时间为2 h，反应物质量浓度为25 mg/mL，以染料木素与磷脂的复合率为评价指标，考察四氢呋喃、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同反应溶剂对复合率的影响，分别平行3 份。

结果表明四氢呋喃作为反应溶剂时，染料木素与磷脂的复合率较其他溶剂高，而且在试验中发现，相比无水乙醇，采用四氢呋喃作为溶剂得到的产物黏性更小，样品更容易分散。因此后续的实验选择四氢呋喃作为反应溶剂。

2.4.2 药物与大豆磷脂投料比的影响 反应溶剂为四氢呋喃，其余条件同“2.4.1”项，分别考察药辅比(染料木素与大豆磷脂的投料比)为:1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4 时的复合率，分别平行3 份。

结果显示药物的结合百分率受磷脂与染料木素投料比的影响较大，随磷脂投入量的增大而结合率增大，当药物与磷脂的比例为1 ∶3 时，所得复合物很黏，且搅拌后容器壁上有一些黏附物，而采用1 ∶1 的比例时，复合效果较差，1 ∶2 的比例较为适中，搅拌后容器壁上干净，且所得复合物黏性适中，易于粉碎。

2.4.3 反应时间的影响 其余条件同“2.4.1”项，考察不同反应时间(1、2、3、4 h)对药物形成复合率的影响。分别平行3 份。

结果表明反应时间对复合率有一定影响，药物与磷脂的反应于2 h 后基本完全。超过2 h 后复合率反而有所下降。

2.4.4 反应温度的影响 其余条件同“2.4.1”项，考察不同反应温度(30、40、50、60 ℃)下染料木素与磷脂的复合率。分别平行3 份。

实验结果表明，随温度升高，药物的复合率有所增加。但是当温度高于60 ℃时，磷脂容易氧化，所以试验的温度不能高于60 ℃。

2.4.5 反应物质量浓度的影响 其余条件同“2.4.1”项，考察不同反应物质量浓度(5、10、20、30 mg/mL)对复合率的影响，分别平行3 份。结果显示反应物质量浓度为20 mg/mL 时的复合率最高，高于或低于此质量浓度均会使复合率降低。

从以上实验结果来看，影响染料木素与磷脂复合率的主要因素是反应物质量浓度、投料比、反应时间，而其他因素影响不大。

2.5 星点设计—效应面法优化实验

2.5.1 实验设计方案 本试验中，根据单因素的考察结果，选择对复合率影响较大的因素作为考察因素，即反应时间(X1)、反应物质量浓度(X2)、染料木素与磷脂投料比(X3)，在确定各因素水平的极大(+α)和极小值(-α)以后，依据水平代码分别求出+1、0、-1 所代表的物理量。±1、0 水平的安排遵循任意两个物理量之间的差值与对应代码之间差值成等比的原则。实验中3 个考察因素的代码水平及对应物理量见表1，以复合率(y)为考察指标，相应的实验结果见表2。

表1 星点设计因素水平Tab.1 Factors ＆ levels of central composite design

表2 星点设计实验安排及结果Tab.2 Central composite test design and results

2.5.2 模型拟合 以复合率为响应指标，应用matlab 7.6 软件，采用最小二乘法分别拟合各响应指标与影响因素间的一次项模型及全二次项模型。在拟合之前，先对各影响因素进行正规化(即使Xnew = Xold/max (Xold)，以消除量纲不一致)。若一次项拟合结果较为理想，则采用该模型;若响应指标与影响因素间的关系较为复杂，采用一次项拟合结果并不理想，则采用全二次项模型进行拟合;最后通过比较复相关系数及P 检验选取较优模型确立为最终拟合模型。对于二项式方程，根据统计软件对各项系数进行的P检验结果，筛除无统计学意义的参数(P ＞0.25)后，再进行二项式方程拟合，达到模型简化之目的。所得方程如下:

(1)多元线性回归方程

y=0.723 6+0.047 7X1+0.121 2X2+0.097 0X3，(r=0.910 3，复相关系数radj=0.892 4，P ＜0.000 1)

(2)全二项式方程为(准入条件为P≤0.25):

其中全二项式方程中各项系数的P 值具体如下:X1:0.188 6;X2:0.003 8;X3:0.037 1;X1X2:0.199 0;X1X1:0.243 7;X2X2:0.037 0;X3X3:0.006 1。

由以上方程可知，全二项式拟合相关系数r 值高于多元线性回归，拟合度高，且预测性好，实测值和预测值基本吻合(见图1)，故选择全二项式拟合模型为最终模型。

图1 预测复合率与实测复合率关系图Fig.1 Relational graph of predicted and actual recombination rate

2.5.3 效应面优化与预测 以简化后的全二项式数学模型为基础描绘等高线图作为效应面，见图2 ～4。

图2 投料比和反应物质量浓度对复合率影响的等高线图(反应时间为2 h)Fig.2 Contour map of the influence of weight ratio and reactant concentration on the recombination rate(the reaction time is 2 h)

图3 投料比和反应时间对复合率影响的等高线图(反应物质量浓度为15 mg/mL)Fig.3 Contour map of the infleunce of weight ratio and reaction time on the recombination rate (the reactant concentration is 15mg/mL)

图4 反应时间和反应物质量浓度对复合率影响的等高线图(投料比为1 ∶2)Fig.4 Contour map of the influence of reaction time and reactant concentration on the recombination rate(the weight ratio is 1 ∶2)

由图2 可知，在一定范围内，当投料比相同时，染料木素与磷脂的复合率随反应物质量浓度的增大而增大;而当反应物质量浓度相同时，复合率随投料比的增大而增高;由图3 可知，投料比质量浓度较低时，反应时间越长复合率越高，当投料比增加到一定值时，复合率不会随着反应时间的延长而不断增加，即在某一区域内复合率增高趋势达到平台期;由图4 可知，当反应物质量浓度增大时，达到相同复合率所需的反应时间越少;当反应时间一定时，反应物质量浓度越高，复合率越高，从二次项方程式可以看出，反应物质量浓度与反应时间之间存在明显的交互作用。

2.5.4 优化工艺及验证 由软件预测的最优条件为:X1=2.1548，X2=25，X3=2 ∶3，预测的y =98.18%。为了确定建立模型与实验结果是否相符，通过进一步实验对模型的可靠性进行验证。在预测优选出的最佳工艺条件下制备染料木素磷脂复合物，共进行4 组实验，取平均值与全二项式方程优选出的最佳工艺条件下模拟的预测值进行比较，结果染料木素磷脂复合物复合率的实验值为(97.57 ±1.03)%，预测值为98.18%，二者相差低于1%，说明模型是比较可靠的，实验所得到的拟合方程可以较好地描述因素与指标的关系。

2.6 染料木素磷脂复合物理化性质的测定

2.6.1 溶解度的测定 取过量的染料木素、染料木素与磷脂的物理混合物(按照复合物的工艺配比，药量和辅料的比例与复合物相同)、染料木素磷脂复合物，分别加入1 mL 的水、正辛醇、二氯甲烷，平行3 份，37 ℃恒温振荡24 h，4 000 r/min离心10 min，上清液加乙醇稀释适当倍数进行染料木素测定。结果见表3。

表3 染料木素及其物理混合物、磷脂复合物在不同溶剂中的溶解度(n=3)Tab.3 Solubility of genistein and its physical mixture，phospholipid complex in different solvents (n=3)

2.6.2 油水分配系数的测定 取适量染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂复合物分别溶于40 mL 水饱和的正辛醇中，放在超声波使其溶解。离心，取上清液，留取母液。从中取10 mL 放入锥形瓶中，加入10 mL 正辛醇饱和的水，平行3 份，恒温振荡24 h，分别取正辛醇层、水层稀释适当倍数后测定其中染料木素含量。采用公式(2)计算Ko/w值。

式中Co、Cw分别为药物在正辛醇层和水层的浓度。

计算得染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂复合物的油水分配系数分别为0.768 9 ±0.064 7、1.093 2 ±0.123 5、0.892 0 ±0.047 0。

3 讨论

在工艺优化和处方筛选过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。采用固定其他因素改变某一因素的单因素考察法能收到一定效果，但也具有一定的局限性，实验次数较多且费用较高，而且无法考察各因素间的交互作用，而因素之间的交互作用对响应指标的影响很大。选择适应于非线性拟合的试验设计方法，可提高实验精确度，提高优化效果。近年来常用集数学和统计学方法于一体的效应面优化法进行优化，实验设计采用中心组成设计 (central composite design，CCD)［7-8］，它能以较少的实验次数对各因素的效应进行非线性估计，并能通过求得的考察指标与各因素间的关系式和效应面，确定在试验范围内的各因素的最佳值，反映各因素及因素间的相互作用对指标值的影响程度。从本实验的单因素考察中无法看出各因素之间的交互作用，而采用星点设计-效应面优化法，不仅可以得到单个因素对指标的影响及影响程度，还得到了各主要因素之间的交互作用，从而取得了较好的实验结果。

由染料木素及磷脂复合物的理化性质可知，将染料木素制备成磷脂复合物后，即提高了它在水中的溶解度，同时也提高了其在有机溶剂中的溶解度。相对于染料木素、染料木素和磷脂的物理混合物在水中溶解度均略有提高，这是由于磷脂是属于表面活性剂，可以在一定程度上起到增溶作用。而在二氯甲烷和正辛醇中也有所提高，可能是由于染料木素在与正辛醇、二氯甲烷搅拌的过程中，也有部分形成了磷脂复合物的形式，或者是由于溶解了磷脂的有机溶剂本身对于染料木素的溶解行为就有所改变。但相对于磷脂复合物，物理混合物在水中和有机溶剂中的溶解度均没有磷脂复合物提高的多。据报道，黄酮类成分等与磷脂的极性基团部分可以发生较强的相互作用，抑制了分子中单链的自由转动，而磷脂的两个长链脂肪酸链不参与复合反应，可自由移动，包裹了磷脂的极性部分形成一个亲脂性的表面，使复合物表现出较强的脂溶性［10］。

从油水分配系数的结果可知，磷脂复合物在正辛醇/水系统的油水分配系数相比染料木素有所提高，但不如物理混合物提高的多，原因可能是由于磷脂复合物同时提高了染料木素在水中和正辛醇中的溶解度，但正辛醇和水中溶解度提高倍数之间的比例不如物理混合物大。

药物的油/水分配系数与药物在生物膜中的分配有关，油水分配系数在一定范围内的增大，会使药物进入生物膜的量增大，有利于药物的跨膜转运，从而使进入体内的药物量增加，生物利用度提高［10］。染料木素磷脂复合物油水分配系数的增大，预示其体内吸收有可能得到提高。但和物理混合物相比，是否可以显著提高还有待进一步研究。

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