不同前处理及显色方法测定粗多糖含量的研究

曹 玉 ，朱坚磐(1.南京市食品药品监督检验院药品所，江苏 南京 10000;.浙江省疾病预防控制中心理化实验室，浙江 杭州 310051)

近年来，随着人们生活水平的提高，对健康的要求也越来越高，保健食品市场也日益繁荣。粗多糖是保健食品中最常添加的功效成份之一，其防癌、提高免疫力、降低血脂和血糖、抗氧化、抗衰老的效果得到了广泛的认同［1-11］。很多植物如香菇、木耳、灵芝、枸杞等都含有粗多糖，但其分子成分却不相同，采用不同的分析方法得出的结果会出现较大的差异。目前，粗多糖尚无国家标准检验方法，对不同的样本采用科学合理的检验方法［12-16］，是保健品中有效成份粗多糖的分析技术的关键。本研究采用不同的前处理方法及显色方法对同一样品进行了检测，结果有显著差异，现报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外可见分光光度计，贝克曼公司生产;DK 一600S 型恒温水箱，上海精宏试验设备有限公司生产;GS-6R 型离心机，贝克曼公司生产。

1.2 试药

(1)葡萄糖标准液:准确称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖标准品0. 500 0 g，加水溶解后，定容至50 ml，此液含葡萄糖10.00 mg/ml;(2)葡萄糖标准应用液:吸取以上标准液1.0 ml，加水定容至100 ml，此液含葡萄糖0.10 mg/ml;(3)50 g/L 苯酚溶液:称取新鲜苯酚5.0 g，加水至100 ml 溶解，放置冰箱中;(4)糖化酶:250 g/瓶，活性10 万/g，(上海蓝季科技发展有限公司，批准文号:080318);(5)硫酸蒽酮试液:精密称取蒽酮100 mg 置于烧杯中，加入75%硫酸100 ml 中(75 ml 浓硫酸加入25 ml 蒸馏水中)溶解，即得，然后转移至棕色瓶中，临用新配。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的制备

准确量取葡萄糖标准应用液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml(相 当 于 葡 萄 糖0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg)，分别置于25 ml 比色管中，准确加水至2 ml，加入苯酚溶液1.0 ml、浓硫酸10 ml，混匀，沸水浴2 min，冷却至室温，485 nm 处1 cm 比色皿测定吸光度，绘制标准曲线。

2.1.1 试样前处理方法一:取样约1 g，加50 ml 蒸馏水溶解，沸水浴2 h，冷却，定容，过滤，备用。准确吸取滤样5.0 ml 置于50 ml 离心管中，加入无水乙醇20 ml，混匀5 rain 后，以3 000 r/min 离心5 min，弃去上清液。残渣用80%(体积分数)乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3 ～4 次。残渣用水溶解并定容至10 ml，取1 ml 稀释至5 ml，混匀后备用。取0.20 ml 样品处理液于25 ml 比色管中，准确补水至1 ml，同标准曲线测定。根据结果计算:

注:C表示由标准曲线计算得来的样液中葡聚糖含量(g)。

2.1.2 试样前处理方法二:取样约1 g，加50 ml 蒸馏水溶解，超声萃取2 h，冷却，定容，过滤，备用，其余同2.1.1。

2.1.3 试样前处理方法三:取样约1 g，加50 ml 蒸馏水溶解，超声萃取2 h，冷却，定容，过滤后置于4 ℃下过夜后，备用，其余同2.1.1。

2.2 前处理方法的方法学比较

2.2.1 2 种方法精密度试验:按不同前处理方法(2.1.1 与2.1.2)处理同一灵芝孢子粉中6 份样液，分别测定其含量，见表1。2.2.2 2 种方法提取效果试验:按不同前处理方法(2.1.1 与2.1.2)处理同一灵芝孢子粉中6 份样液，分别测定其含量，见表1。

表1 2 种方法测定破壁灵芝孢子粉中粗多糖含量的比较(%)Tab 1 Comparison of determination of crude polysaccaride content in sporoderm-broken spore powder of two methods(%)

2.3 乌药精粉精密度试验及提取效果试验结果

乌药精粉采用2.1.1 前处理方式，方法RSD% =1.205，样本含量平均值为2.607%;乌药精粉采用2.1.2 前处理方式，方法RSD% =8.409，样本含量平均值为1.765%。结果显示:沸水浴2 h，样本含量的精密度和提取效果均较超声效果好。

2.3.1 2 种方法的精密度试验:按不同前处理方法(2.1.1 与2.1.3)处理同一乌药精粉中6 份样液，分别按法测定其含量，见表2。

2.3.2 2 种方法的提取效果试验:按不同前处理方法(2.1.1与2.1.3)处理同一乌药精粉中粉中6 份样液，分别按法测定其含量，见表2。

2.4 破壁灵芝孢子粉精密度试验及提取效果试验结果

破壁灵芝孢子粉采用2.1.1 前处理方式，方法RSD% =6.671，样本含量平均值为12.992%;破壁灵芝孢子粉采用2.1.3 前处理方式，方法RSD% =0.760，样本含量平均值为10.308%。结果显示，采用2.1.3前处理方式的提取效果优于采用2.1.1 前处理方式，可见沸水浴2 h 提取效率优于超声的提取效率。

表2 2 种方法测定乌药精粉中粗多糖含量的比较(%)Tab 2 Comparison of determination of crude polysaccaride content in lindera aggregata flavor powder of two methods (%)

2.5 不同显色方式的方法学比较

2.5.1 2 种显色法:(1)苯酚硫酸显色法:见2.1.1。(2)蒽酮硫酸显色法:准确量取葡萄糖标准应用液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml(相当于葡萄糖0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg)，用刻度吸管补蒸馏水至2.00 ml，摇匀，分别于冰水浴中滴加2 g/L 蒽酮硫酸试剂5 ml，注意保持混合物冷却，加完后密封，摇匀，于沸水浴中加热10 min，迅速置冷水浴冷却10 min 后，以首管为空白于625.80 nm 测吸光度。

2.5.2 2 种显色法测定样本中粗多糖含量的比较:在2.1.1前处理方法下，分别采用苯酚硫酸显色法和蒽酮硫酸显色法测定样品，见表3。结果表明，2 种显色方式对测定结果无明显差异。

表3 2 种显色法测定样本中粗多糖含量的比较(%)Tab 3 Comparison of determination of crude polysaccaride content in different samples between two kinds of colorimetric methods(%)

3 讨论

3.1 不同显色法比较

苯酚硫酸显色法和蒽酮硫酸显色法所测粗多糖线性、稳定性较好，是目前测定多糖较为理想的方法，操作简便，稳定可靠，适合大多数样本中多糖的常规检测，且不需要精密仪器，适用基层单位使用。苯酚硫酸显色法测定多糖的含量，关键在于要将原同体苯酚重新蒸馏，去除其中被氧化的醌类等杂质，提高试验的准确性;而蒽酮硫酸显色法中，由于蒽酮在空气中易变质，故溶液应现配现用;由于其对温度较敏感，大约加热10 min 左右，作出曲线线性较好。以上2 种方法均需用到冰水浴迅速降温，以减少副产物的形成。本试验中还发现，浓硫酸的加入方式对试验的结果有影响，采取移液管悬空，垂直加人浓硫酸，立即摇匀的方式，颜色反应充分，显色结果稳定，故在测定中应避光或迅速操作，以获得理想的重现性。

3.2 不同前处理方法比较

不同样本需要用不同的前处理手段，在破壁灵芝孢子粉中发现，未经4 ℃静置的样本，明显浑浊，可能含有与多糖相近性质的物质进入，造成试验结果不准确，故需在测定样本前，多做预试验。

［1］ 张换，曾艳，管于平，等. 响应面法优化海带多糖的酶法提取工艺及其抗氧化研究［J］.食品科技，2013，38(5):197-202.

［2］ 尚晓娅，钦传光，曹刚，等.绞股蓝多糖提取分离、化学结构及生物活性的研究进展［J］. 天然产物研究与开发，2010，22(3):514-518，540.

［3］ 张黎，杨艳. 茶多糖药理活性研究进展［J］. 中国实用医药，2013，8(16):255-257.

［4］ 王秀娟，梁久伟，詹冬玲.海带多糖饮料的研制［J］.食品研究与开发，2012，33(7):93-95.

［5］ 李新明，张永茂，熊善柏.红枣多糖饮料的研制［J］.粮油食品科技，2012，20(1):46-47，64.

［6］ 梁静，刘晓宇，邓碧云，等.红枣粗多糖的提取及抗氧化活性评价［J］.食品科技，2012，37(1):177-181.

［7］ 方丽.菊花多糖饮料的研制［J］. 中国食物与营养，2010，6(9):53-55.

［8］ 朱亮，石海春，罗强，等.玉米须多糖的提取、组成和生物活性研究［J］.四川大学学报:自然科学版，2013，50(3):631-637.

［9］ 周桃英，袁仲，崔东波.莲藕多糖保健饮料抗疲劳活性试验研究［J］.江苏农业科学，2011(1):329-330.

［10］ 陈刚，郭晓蕾，宝丽.银耳、麦冬、燕麦多糖的抗氧化活性及吸湿保湿性能研究［J］. 中华中医药学刊，2013，31(1):212-214.

［11］ 刘洋洋，安莹莹，秦文娟，等.黄精多糖药理作用研究进展［J］.泰山医学院学报，2014，35(9):967-970.

［12］ 刘丹.对多糖测定方法的探讨［J］. 四川文理学院学报:自然科学版，2008，18(2):49-51.

［13］ 王燕萍，杨君，冯慧予，等. 粗多糖测定方法的选择对分析结果的影响［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(9):2171-2174.

［14］ 黄东萍，文东旭，林文翰.天芎注射液中多糖的含量测定［J］.华西药学杂志，2005，20(2):167-168.

［15］ 何永超，刘雅敏，朱艳慧，等.苯酚-硫酸显色法测定炙甘草汤的总多糖含量研究［J］.中医学报，2013，28(4):547-549.

［16］ 韩江伟，杨夏，孙丽君，等. 奶制瑞香狼毒中多糖含量的蒽酮-硫酸法测定［J］.时珍国医国药，2011，22(6):1332-1333.