聚乙烯醇降解菌的筛选与降解条件优化

李 坤， 李江华*，3， 刘 龙，3， 堵国成，2，3， 陈 坚，2，3

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122；3.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

聚乙烯醇降解菌的筛选与降解条件优化

李 坤1， 李江华*1，3， 刘 龙1，3， 堵国成1，2，3， 陈 坚1，2，3

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡214122；3.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

为了实现纺织工业废水中PVA1799的生物降解，从纺织印染厂区筛选到一个能快速降解培养基中PVA1799的混合菌系，命名为SH-TD。从中分离出3株纯培养菌株，分别命名鉴定为SH1（Aeromonas sp.），TD5（Pseudomonas sp.），TD33（Acinetobacter sp.）。通过对含PVA1799出发培养基进行单因素及Placckett-Burman实验筛选出三个对PVA1799降解有显著影响的因素分别为Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O。然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域，最后通过Box-Behnken设计，利用Design-Expert软件进行回归分析，得到各因素的最佳质量浓度组成为（g/L）：Yeast-Extract 0.04、（NH4）2HPO448.42、BaCl20.06。在最优条件下，24 h PVA降解率从原先的30%提高到80%。

聚乙烯醇；混合菌系；生物降解；响应面法

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，简称PVA），是目前已发现的惟一具有水溶性且无毒的高聚物[1]，具有很多优良的物理性质，如高粘度、成膜性、乳化性、拉伸性、对水、油脂和有机溶剂均有抵抗性等。基于以上特性，PVA广泛应用于粘合剂、涂料、乳化剂、造纸和纺织等行业，工业上通常通过聚醋酸乙烯酯经过皂化反应制取[2]。PVA的生化性较差（BOD/COD）=0.07，在许多工业废水中含有大量的 PVA，直接排放会对环境带来了极大的污染[3]。1973年日本科学家Suzuki首次分离到可以单独降解PVA的Pseudomonas O-3[4]，随后几十年里国内外进行了大量的PVA降解微生物的筛选、酶基因的克隆等工作[5-9]。目前已正式报道的PVA降解酶包含三个种类[10]：PVA氧化酶 （仲醇氧化酶）（EC 1.1.3.30）、PVA脱氢酶 （EC 1.1.99.23）和氧化型PVA水解酶 （β-双酮水解酶）（EC 3.7.1.7）。近年还发现了专一性比较强的降解低醇解度PVA长链上残存乙酸酯键的PVA酯酶[11]。然而大部分报道菌种都存在培养周期长，酶活低等缺点。所克隆出来的PVA脱氢酶更是由于其在作用时需要昂贵的吡咯喹啉醌（PQQ）作为电子受体而在工业生产中具有很大的局限性，而PVA氧化酶则由于难以纯化而至今未能被克隆。因此分离筛选新的PVA降解微生物尤其是具有PVA氧化酶活性的菌株具有十分重要的意义。

作者从纺织厂、印染厂等废水、土壤及活性污泥中筛选出1株高效降解PVA1799的混合菌系，并从中分离出3种纯培养物，通过对所得混菌体系降解PVA的培养基设计响应面优化实验，大大提高了PVA降解酶的产率，缩短了降解时间，为进一步深入研究该混合菌中的PVA降解酶的种类及降解机理提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 取自无锡太平洋和军达纺织厂等地的废水、土壤及活性污泥。PVA1799（聚合度1 700，醇解度99%）：由江南大学纺织服装学院提供。

1.1.2 培养基

1）富集培养基P-Y（g/L）：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.1，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02，CaCl2· 2H2O 0.01，NaCl 0.02；pH 7.5。

2）鉴定培养基P-Y（g/L）：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.1，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02，CaCl2· 2H2O 0.01，NaCl 0.02，琼脂粉20；pH 7.5。待平板长出菌落后倾入15 mL碘-硼酸试剂，避光反应10 min，观察菌落周围透明圈的产生情况。

3）种子培养基P-TY：20%LB，P-Y。

4）起始发酵培养基P-Y：同富集培养基。

1.2 筛选及培养方法

1.2.1 菌株筛选与鉴定 将样品用无菌生理盐水悬浮，取上清液用富集培养基过夜培养，梯度稀释至合适浓度，涂布于鉴定培养基平板，30℃培养3 d。显色后，挑取有透明圈菌落在鉴定培养基平板上进行多次划线分离，直至得到纯培养菌株即为初筛菌株。接种初筛菌株于种子培养基中培养18 h，取3 OD600种子液离心无菌重悬接种发酵培养基P-Y中传代驯化并测定PVA含量。

观察目的菌株菌落形态、镜检并进行革兰氏染色实验，提取其16S rDNA并测序，在NCBI上比对所得测序结果将纯菌鉴定到属 （http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）。

1.2.2 种子培养 从甘油管中取50 μL菌液于接入装有20 mL P-TY培养基的250 mL三角瓶，并在30℃、200 r/min下培养18 h。

1.2.3 发酵培养 250 mL三角瓶装液量20 mL，接种量3 OD，30℃、200 r/min培养测定PVA降解率及PVA降解酶总酶活。

1.2.4 粗酶液制备 取发酵培养液，10 000 r/min离心8 min，所得上清液即为粗酶液组分1。去上清菌体，加等体积的20 mmol/L、pH 7.5 PBS缓冲液重悬后超声波 （400 W）处理20 min，其中破碎3 s暂停1 s，破壁后10 000 r/min离心8 min，所得上清液即为粗酶液组分2。混合组分1、2即为粗酶液。

1.3 分析方法

1.3.1 菌浓测定 取发酵液稀释至合适的吸光度范围在600 nm处测定其吸光度。

1.3.2 PVA浓度的测定 改良的Finley法[12]。取400 μL发酵上清液加入10 mL具塞比色管，加入3 mL、25 g/L硼酸溶液，最后加300 μL 0.1 mol/L I2-KI溶液，用去离子水定容至10 mL，避光反应10 min，以水替换发酵上清液作为空白对照，以发酵前培养基作为标准对照，1 cm光程690 nm波长下测定吸光度。

1.3.3 PVA降解酶总酶活 取粗酶液2 mL，加入15 mL离心管中，与溶解在pH 7.5、20 mmol/L PBS缓冲液中的2 g/L PVA溶液均匀混合，于30℃下振荡保温5 h。分别测定反应前后混合液在690 nm下的吸光度，每分钟吸光度下降0.001定义为一个酶活单位（U）[8]。

1.4 培养基优化[13]

摇瓶培养基优化策略选用响应面优化，以单因素实验确定最优氮源，通过Plackett-Burman实验找出对PVA降解有显著影响的因素，挑选具有显著效应的因素进行最陡爬坡实验，然后通过爬坡实验确定中心组合实验的中心点，最后进行中心组合实验。使用Design-Expert软件对实验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选与鉴定

将从纺织印染厂采集来的土样、活性污泥样等用生理盐水重悬、静置后取上层清液用富集培养基P-Y培养基于200 r/min、30℃培养，期间间断取样测定PVA浓度的变化，每次富集时间6 d。经过3次循环富集驯化，得到一个能在4 d内降解P-Y培养基中全部PVA的混合菌体系，命名为SH-TD，这也是本研究后期工作的研究对象。对混合菌系稀释合适的梯度涂布分离鉴定平板，经Finley法显色后，挑取有透明圈的菌落多次在鉴定培养基上反复划线纯化，得到了3个菌落形态不同的纯菌落，分别命名为SH1，TD5，TD33，图1为TD5透明圈图。以三株菌的基因组为模板，以27F、1492R通用引物PCR分别得到其16S rDNA序列，测序后分别在NCBI上进行比对，三株纯菌分别鉴定为Aeromonas sp.，Pseudomonas sp.，Acinetobacter sp.，对3株菌构建系统发育树，见图2。

图1 TD5菌落形态及透明圈Fig.1 Colonial morphology and transparent circle of TD5

图2 3株PVA降解菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of three isolated PVA-degrading bacterium

2.2 单因素实验

在去除氮源的P-Y中，添加不同的氮源 （有机氮源和无机氮源，控制每种氮源的含氮量均为0.2 g/L），探究不同氮源对PVA降解及产酶的影响。添加的有机氮源分别为Yeast-Extract、蛋白胨和牛肉膏；添加的无机氮种类分别为（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2HPO4、CH3COONH4、（NH4）2C2O4、柠檬酸三铵、NH4HCO3。每种氮源做三个平行，培养48 h，测定各处理中PVA的浓度。由图3可见，（NH4）2HPO4为最优氮源。

图3 不同种类氮源对PVA降解率的影响（48 h）Fig.3 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity（48 h）

2.3 Plackett-Burman实验

作者选用实验次数N=12的Plackett-Burman实验设计，对8个因素进行考察，分别为Yeast-Extract，（NH4）2HPO4，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，NaCl。每个因素分两个水平，高水平取低水平的1.5倍，响应值为培养12 h后培养基中PVA的降解率（%）。实验设计及结果见表1，利用Design-Expert软件对Plackett-Burman实验各因素主效应分析的结果见表2。由表2可知，Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O和 KH2PO4这四个因素的可信度都在95%以上，其余四个因素的可信度均低于95%，同时考虑到在进行响应面分析时，因素超过3个会使实验次数显著增加，而在以上4个显著因素中，K2HPO4的影响相对差一些，而且CaCl2·2H2O可能与PVA降解的吸附降解机理有关。因此确定Yeast-Extract、（NH4）2HPO4、CaCl2· 2H2O为主要影响因素进行下一步实验。

2.4 爬坡实验

根据Plackett-Burman的结果确定下一步实验的最陡爬坡路径。通过PB实验分析可知，Yeast-Extract有负效应，应减少；（NH4）2HPO4、CaCl2·2H2O有显著正效应，应增加。根据这三个因素效应大小的比例设定它们的变化方向以及步长，其他五个因素分别取各自的低水平进行实验，实验设计及结果见表3。从结果来看，最佳因素的质量浓度处于第8组和第9组之间，故以第8组条件为后续实验的中心点进行响应面分析。

表1 Plackett-Burman实验设计和响应值Table 1 Plackett-Burman experiment design and its response

表2 Plackett-Burman实验因素水平及其主效应分析Table 2 Levels of variable and analysis of the main effect for Plackett-Burman

表3 爬坡实验设计及结果Table 3 Experimental design and result of ascent

2.5 响应面分析重要因素的最优质量浓度水平

2.5.1 二次回归模型拟合及方差分析 根据Plackett-Burman实验确定了影响PVA降解速率即产酶的主要因素，Box-Behnken实验各因素水平见表4，实验设计及结果见表5。

表4 Box-Behnken实验因素水平Table 4 Experimental variables and levels for BB design

表5 BB实验设计与结果Table 5 Design and results of BB experiment

以Yd为响应值，根据表5中Box-Behnken设计的实验结果，利用Design-Expert软件对其结果进行二次回归分析，得到回归方程为：

从方差分析表6中可以看出，模型在α=0.01水平上回归显著；同时，一次项、平方项、交叉项均对响应值有显著性影响。模型可信度分析见表7，其中复相关系数的平方 R2=0.989 5，说明模型可以解释98.95%实验所得PVA降解率的变化，表明方程拟合较好。本设计实验中CV=2.79%，较低，说明实验操作可信。综上说明回归方程给PVA降解率的变化提供了一个合适的模型。

表6 模型方差分析Table 6 NOVA for the full quadratic model

表7 模型的可信度分析Table 7 Fit statistics for the model

2.5.2 响应面分析及最优浓度的确定 通过回归方程分析得到极大值所对应主要因素X1、X2、X3，即Yeast-Extract、（NH4）2HPO4和CaCl2·2H2O的质量浓度分别为0.04、48.42、0.06 g/L，此时24 h后的PVA降解率最高，为80.84%。以确定的主要因素质量浓度配制培养基，分三批次，24 h PVA降解率平均为79.76%，与预测值基本相符。PVA降解酶酶活大大提高，降解周期缩短至36 h内。

图4 响应面立体分析图及对应等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot of central composite experiment

3 结语

通过富集驯化，得到一个快速降解培养基中PVA1799组分的混合菌系SH-TD，从中分离出三种纯菌，它们分别是 SH1 （Aeromonas sp.），TD5（Acinetobacter sp.）和TD33（Pseudomonas sp.）。

采用响应面分析法对PVA降解菌降解PVA的发酵培养基进行优化，首先运用Plackett-Burman法确定出Yeast-Extract、（NH4）2HPO4和CaCl2·2H2O为重要影响因素；然后通过最陡爬坡实验逐步改变三者的质量浓度，逼近中心点；最后采用Box-Behnken设计和Design-Expert软件分析确定出主要因素的最优质量浓度，得到最佳发酵培养基组分（g/L）为：PVA1799 1，Yeast-Extract 0.04，（NH4）2HPO448.42，KH2PO40.02，K2HPO41.6，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02，CaCl2·2H2O 0.06，NaCl 0.02；pH 7.5。此时24 h后的PVA降解率最高，为80.0%。降解效率与原初始发酵培养基相比提高了1.7倍。PVA降解酶总酶活大大提高，为进一步研究打下了坚实的基础。

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Screening of PVA-Degrading Strains and Optimization of Degradation Conditions

LI Kun1， LI Jianghua*1，3， LIU Long1，3， DU Guocheng1，2，3， CHEN Jian1，2，3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to achieve the biodegradation of PVA1799 in the textile industrial waste water，an bacteria mixture with efficient degradation was screened and named as SH-TD.Three strains with PVA-degrading ability were isolated from the mixed culture SH-TD and nasmed as SH1（Aeromonas sp.），TD5（Pseudomonas sp.），and TD33（Acinetobacter sp.），respectively.The results from the single factor and Plackett-Burman experiments showed that Yeast-Extract，（NH4）2HPO4and BaCl2constituents have the significant influence on PVA degrading rate.Through ascent and Box-Behnken experiments，a response surface methodology（RSM）model was constructed.Data were analyzed by use of Design-Expert software.The optimal concentrations（g/L）of the variables were determined as （g/L）：Yeast-Extract 0.04，（NH4）2HPO4 48.42，BaCl20.06.Under the optimalconditions，the PVA degradation rate after 24 h increased from 30%to 80%.

polyvinyl alcohol，mixed bacteria，biodegradation，response surface methodology

TQ 92

A

1673—1689（2015）08—0835—07

2014-02-19

国家863计划项目（2012 AA022202）。

*通信作者：李江华（1966—），男，江西九江人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事酶技术、发酵过程优化与控制方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn