低温驯化速度对鲫鱼离水储藏酶活性的影响

曾 鹏， 申 江， 陈天及

（1.上海海洋大学 食品学院，上海201306；2.天津商业大学 机械工程学院，天津300134）

低温驯化速度对鲫鱼离水储藏酶活性的影响

曾 鹏1， 申 江*2， 陈天及1

（1.上海海洋大学 食品学院，上海201306；2.天津商业大学 机械工程学院，天津300134）

为研究低温驯化及储藏温度对鲫鱼活体离水后储藏的影响，成年鲫鱼(Carassius carassius)放置于水箱中，采用每小时5℃和1℃速率,由25℃匀速降温降至0℃，分别在4℃和0℃冷库中离水储藏24 h，测定鲫鱼新陈代谢及抗氧化相关酶的活力，并探讨低温驯化及离水储藏对鱼体生理状态的影响。结果表明，1℃/h降温有利于乳酸脱氢酶（LDH）活力的保存。经过1℃/h降温驯化后，0℃储藏异柠檬酸脱氢酶活力功能得到了一定保存，脑琥珀酸脱氢酶（SDH）未受影响。丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力体现为受储藏温度影响，0℃下其活力得到保存。0℃储藏导致丙二醛（MDA）的积聚，同时低温储藏中血液过氧化氢酶（CAT）集聚而肝脏未表现出明显变化。

丙二醛；线粒体；低温驯化；氨基酸

鱼体降温到生理冰温点附近的温度，就会处于休眠状态以延长存活时间，使之可离水储运的技术称为鱼体冰温技术。该技术使得低温驯化增加了生物体的低温耐受性，并且低温下其新陈代谢降到最低水平，从而能保持活体的长时间储藏[1]。

生物对环境的代偿作用可以在多种环境改变诱导下发生。例如温度、压力、重金属、缺氧等。通常认为对环境的适应可以为生物体提供有益的代偿。其中，对温度的驯化适应称为“温度适应”[2]。在不适合生存的温度下，变温生物可以通过温度适应策略来满足正常生理功能。极端温度下生活的鱼类及不同季节温度下鱼类酶动力学研究为鱼类低温驯化机理提供了大量资料[3-4]。酶的活性因为有其最适温度的限制，偏离此最适温度的生物，其酶功能都会受到不利影响而导致酶功能的下降。具有不同温度驯化性的鱼类，其酶的最适温度也有变化以适应驯化温度对酶活性的影响，保证机体正常生理活动[5]。温度驯化过程通常通过提高代谢酶的活力，即通过改变酶的浓度或者通过酶可替换结构的改变产生不同最适热性质酶（同工酶），或者改变细胞膜的磷脂组成进而保证酶功能，以应对温度的改变[6-7]。

温度驯化可以引发生理代偿机制，但是环境的快速变化却会导致应激反应。在胁迫应激条件下机体代谢会紊乱，从而导致自由基的大量积聚和细胞组分的氧化状态，而 机体内抗氧化酶通过氧化还原将自由基降解，以维持机体的正常状态。 抗氧化酶活力的变化可以反映出鱼体受到环境影响程度，通常作为机体受胁迫程度的指标。例如，酶活力指标可以在鱼体受到严重伤害前作为水体污染的指标。这些指标同细胞损伤联系，可以作为早期检测标准之一[8]。

鲫鱼肉质鲜美，分布广泛，中国各地常年均有生产，为中国重要食用鱼类之一。市场上鲫鱼以鲜活品为主，死鱼通常不被消费者接受。作者以鲫鱼的酶活性为指标，研究离水及低温状态的生理状态，反映活体低温驯化能力及低温损伤，为鲫鱼的无水保鲜的初步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 低温驯化及储藏温度

成年鲫鱼20±2℃采集自天津本地养殖鲫鱼，体重189.91±13.65 g。选取5条鲫鱼作为对照组。20条成年鲫鱼分别放养在2个50 L聚乙烯水箱中，每箱10尾。由室温18°C采用两种降温速率：5℃/h和1℃/h，降温到0℃，用温度巡检仪(MX100,日本恒河产)与HPt热电阻(精度±0.12℃)监控水体温度。

温度降至0℃时，试验鲫鱼分为两组，各取10尾鱼分别放置于4℃和0℃两座电脑控温冰温冷库中离水储藏。24 h后复水观察存活率，并取5条活鱼取样实验。

1.2 取样

1.2.1 血样 心脏静脉取血，用肝素钠小管采集样品，低温离心20 min（4℃、4 000 r/min），然后-80℃保存待测。

1.2.2 肝脏及脑组织样品 组织分离后，-80℃冷冻。称重后按1∶10加入50 mmol/L的磷酸钾溶液（pH 7.0，包含0.5 mmol/L EDTA）研磨破碎，然后低温离心20 min（4℃、4 000 r/min），取上清液离心30 min（4℃、12 000 r/min），得上清液（PMS）及沉淀（线粒体）。

1.3 有氧及无氧代谢

1.3.1 肝脏和脑异柠檬酸脱氢酶（IDH） 异柠檬酸脱氢酶活性测定：线粒体原液加入反应体系（EDTA 0.33 nmol/L，二硫苏糖醇0.1 mmol/L，Tris-HCl 33 mmol/L，pH 7.0，MgSO41.4 mmol/L，NADP 0.1 mmol/L，异柠檬酸1.5 mmol/L），记录30℃、340 nm吸光值每分钟的变化[9]。

1.3.2 琥珀酸脱氢酶（SDH）酶活性的测定 pH 7.2的磷酸盐缓冲液 （K3PO4·3H2O 35 mmol/L，MgCl 25 mmol/L，NaN32 mmol/L）2.7 mL，线粒体蛋白 0.1 mL，25 mmol/L K3Fe（C N）660 μL，25 mmol/L琥珀酸钠60 μL，注在冰浴中加各试剂和样品，将各管内体积用磷酸盐缓冲液扩充至3 mL后，420 nmol/L比色，读取初值，30℃水浴30 min，取出放入冰浴以终止反应，比色，读取终值。

1.3.3 肝脏乳酸脱氢酶（LDH）酶活性的测定 反应速率以NADH氧化导致340 nm吸光值的减少确定。反应体系包括0.1 mL、6.6 mmol/L NADH，0.1 mL、30 mmol/L丙酮酸钠，2.8 mL、0.2 mol/L Tris-HCl buffer（pH 7.3）；加入0.1 mL肝脏组织PMS样品，记录25℃下的ΔA340/min[10]。

1.4 氨基酸代谢

1.4.1 脑谷氨酸脱氢酶（GDH）酶活性的测定 反应速率以NADH氧化导致340 nm吸光值的减少确定。0.125 mmol/L NADH加入1 mL反应混合物（包含 50 μL PMS，200 mmol/L NH4Cl，30 mmol/L α-KGA溶于100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 8.0），记录A340nm的减少。1单位NAD-GD定义为氧化1 nmol NADH/（min·mg）需要的酶量[11]。

1.4.2 肝转氨酶活力的测定 反应体系包括1 mL底物：2 mmol/L α-酮戊二酸，0.2 mol/L天冬氨酸 用于 谷氨酸氨基转移酶（ALT）和2 mmol/L α-酮戊二酸，0.2 mol/L丙氨酸 用于谷草转氨酶（AST）；底物与0.2 mL上清液在40℃水浴孵育30 min（AST）或60 min（ALT）。加入1 mmol/L、1 mmol/L DNPH终止反应。20 min后，每个反应体系加入10 mL、0.4 mol/L NaOH。以水做空白对照，30 min后记录505 nm光吸收[12]。

1.4.3 脑谷氨酸脱氢酶（GDH）的测定 反应速率以NADH氧化导致340 nm吸光值的减少确定。0.125 mmol/L NADH加入1 mL反应混合物 （包含50 μL PMS，200 mmol/L NH4Cl，30 mmol/L α-KGA溶于100 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 8.0），记录A340nm的减少。1单位NAD-GDH定义为每分钟氧化1 nmol NADH需要的酶量[13]。

1.5 抗氧化酶及脑MDA

1.5.1 过氧化氢酶（CAT）活性测定 测定管（U）取上述溶血液30 μL加入1 mL预温至37℃的基质液，置37℃水浴。准确计时60 s，加入1 mL钼酸铵终止反应，空白1（B1）：依次加入1 mL基质液，1 mL钼酸铵，30 μL溶血液；空白2（B2）：加入1mL基质液，1 mL钼酸铵，30 μL蒸馏水。5 min后分光光度计，405 nm、10 mm小比色皿，以蒸馏水调零比色。

1.5.2 脑丙二醛（MDA）测定 取脑组织PMS样品0.2 mL于试管中，加入pH 7.4的PBS 0.8 mL，充分混匀以后加1.80 mol/L TCA 0.5 mL。用漩涡混匀器充分混匀，放置冰浴2 h。取出后2 000 r/min离心15 min，吸取上清液1 mL。加入100 mmol/L TBA 0.25 mL。置沸水中烧煮20 min后流水冷至室温。波长535 nm，光径1 cm的微量比色皿比色。同样方法制作一对照管，但不放置沸水浴。数据处理使用SPSS 11采用双因素Avona分析。

2 结果与讨论

2.1 代谢酶

不同降温组血糖差异明显。 II组降温血糖低（p=0.00），显示长时间低温驯化导致血糖的大量消耗。同时I组中0℃储藏较4℃也有下降（p=0.04），见表1。

Ⅱ组异柠檬酸脱氢酶活力在0℃较4℃储存组高（P=0.02），各组均低于正常组，差异极显著 （p= 0.00）。显示有氧代谢的抑制，而低温驯化及较低温度储藏对其活力有一定的保护作用。

表1 血糖及糖代谢酶比较Table 1 Blood glucose and glycometabolism enzymes

仅Ⅰ组脑异柠檬酸脱氢酶在4℃的明显升高（p=0.05），其他较正常组无明显差异。脑SDH各组无明显差异，同时观测到，作为线粒体内膜上的酶，其结果反应膜脂流动性在驯化及离水低温下保持稳定。LDH乳酸脱氢酶受低温驯化影响，I组含量均较正常组降低（p=0.02）。尤其I组在4℃较低（p= 0.00），较高温度储藏对其活力有明显损伤。而1℃降温同正常组无明显差异。Ⅱ组4℃乳酸含量较高（p=0.05），低温驯化保留了酶活力，同时较高的储藏温度提高了乳酸的集聚。

2.2 氨基酸

Alt受储藏温度影响，0℃储藏活力较正常组明显下降 （p=0.03）。而4℃较正常无明显差异，GDH及AST仅显示Ⅰ组在4℃较正常组有明显降低，见表2。

2.3 CAT及脑MDA

肝脏中抗氧化酶活力没有明显差异。血液CAT活力受降温速率影响，5℃快速降温组血液CAT含量较高，而慢速降温组CAT活力降低（p=.047）。不受储藏温度是0℃或是4℃的影响（p=0.67），显示降温过程中血液中R抗氧化酶活力受到影响，低温驯化导致血液CAT含量升高。

MDA含量受储藏温度影响，0℃储藏导致MDA集聚，其含量较正常值明显升高（p=0.45）。同时II组即较长的驯化时间组，其脑MDA含量较短期驯化I组较高，而4℃储藏MDA含量增加量较少。

表2 氨基酸代谢酶活力Table 2 Enzymes of amino acid metabolism

表3 抗氧化酶活性Table 3 Antioxidases activity

3 结语

3.1 代谢

代谢缺氧及低温都会对酶活力产生影响[14]。环境胁迫下，鱼类表现为代谢降低，同时需要保证抗氧化能力，即温度变化会导致血糖增加并导致糖原分解加剧[15]。寒冷导致糖原异生从而血糖增加，而温度升高会导致糖原分解加强[16-17]。

各储藏组均显示血糖的大量消耗，同时低温离水条件下肝脏有氧代谢受到了明显抑制。异柠檬酸脱氢酶的变化显示，低温下代谢受到明显抑制，同时经过低温驯化后，Ⅰ组于0℃储藏异柠檬酸脱氢酶活力功能得到了一定保存。脑SDH结果表明，膜脂流动性在长时间驯化及离水低温下保持稳定。淡水热带鱼Prochilodus lineatus在30℃热驯化时，糖分解酶（己糖激酶HK，磷酸果糖激酶PFK，丙酮酸激酶PK，乳酸脱氢酶LDH）总体呈减少趋势，其结果导致糖代谢提供的能量减少[18]。

LDH是鱼类低温驯化研究较多的酶之一，Km是酶促反应中的速率常数,较低的表观Km值反映了酶对底物较高的亲和力，泥鳅卵母细胞经不同温度驯化后，其LDH最低表观Km值跟随驯化温度波动而变化，显示酶在温度变化后仍能保证与底物的高亲和力，维持正常的酶促反应速率[19]。经过低温驯化而肝脏中乳酸脱氢酶也得到了保存，保留了正常的无氧代谢能力。

低温酶功能的驯化体现了机体代谢途径发生转换和重组，通过不同组织同工酶的表达可以满足代谢驯化。在温度驯化过程中，从肌肉和肝脏组织中都发现，LDH同苹果酸脱氢酶同工酶表达增加[7]。但同时也有结果显示，某些酶的同工酶表达没有受到影响，而其结构的细微变化是酶的热驯化的机理。对细胞基质丙氨酸转氨酶研究指出，不同温度环境下驯化鱼类具有相同的亚基，即54 000和56 000亚基。这些结果表明，肝脏丙氨酸转氨酶，驯化不同的生命模式，保持不变的结构。然而就动力学水平而言，肝脏丙氨酸转氨酶对L-丙氨酸底物的亲和力及抑制剂影响显示出极大的差别。这些功能上的变化似乎体现酶动力学仅有细微变化，能够满足鱼类的代谢以驯化不同环境需求[3]。通常认为酶结构只需要一个或很少氨基酸序列即可满足温度驯化的需要[6]。经过低温驯化后，鲫鱼酶活力的保留有利于逆境下保留机体代谢能力。

3.2 氨基酸代谢

I组4℃储藏条件下GDH、AST下降，而 Leu较其他组低显示了转氨酶活力下降，表现出脑内氨基酸直接利用减少；结合转氨酶的活力降低，对氨基酸的利用降低，LDH也较低，显示其无氧代谢能力的下降，Leu的消耗增加。脑GDH及肝脏AST仅显示Ⅰ组4℃较正常组有明显降低。其他各组均保留活性。谷氨酸脱氢酶，作为不需氧的氨基酸脱氢酶，其活力的保留可在低温下为鱼体直接提供能量。

鱼类氨基酸成分随鱼获物捕获季节及所食物料成分改变而不同。例如，Lys和Arg成分在夏季收获的鱼中含量较高[20]。氨基酸在冷驯化过程中具有多种作用。有文献报道，香鱼在冷驯化中有甘油大量积聚，而这些甘油的合成起初使用葡萄糖为糖原，然后使用氨基酸作为碳源[21]。活体组织通过积聚氨基酸抵抗冷胁迫[22]。亲水性氨基酸例如Asp，Thr，Ser能使机体中的结合水增加，有助于应对低温[23]。His、Tyr、Cys和Met具有易被氧化的结构，glu具有防止肌肉蛋白质变性及抗氧化的重要作用[24]。各种游离氨基酸的变化对在降温无水胁迫中的抗氧化作用可能有重要意义，而对于低温储藏的生理机理仍需进一步研究。

3.3 抗氧化

0℃储藏导致MDA的积聚，显示零度储藏下脂类过氧化加剧。而脑SDH各组无明显差异，作为线粒体膜功能指标，其结果反应膜脂流动性在驯化及离水低温下保持稳定。通常认为低温影响细胞膜脂质结构。而机体通过等粘性调节驯化逆境，等粘性调节理论认为通过改变膜脂肪结构，保持膜流动性的最适状态，以应对压力及温度变化[25]。冷驯化后细胞膜流动性增加。鱼类通过增加膜脂不饱和度改变提高细胞膜流动性[26]。而低温胁迫也可以导致膜脂流动性下降，进而对细胞造成损害并影响体内酶活性，同时膜流动性的改变会导致膜结合蛋白活性改变[27]。 酶动力学显示，5-核苷酸酶最大反应速度同肌肉微粒体磷酸中饱和/不饱和脂肪酸的浓度相关，而后者受生存温度的影响[28]。肌质网中的Ca-ATPase活性同生存温度相关。Arrhenius plot显示其酶活力在鱼体生活温度附近存在平衡区间，酶动力学特性可能是受到脂类环境与酶交互作用的调节[29]。

温度胁迫会使鱼体产生抗氧化反应，导致脂类过氧化产物MDA增加，抗氧化酶活性升高，在最适温度最低，并且在高于或者低于这一物种最适温度时升高[30]。高温驯化使酶增加脂过氧化和酶过氧化。金鱼热应激后短期暴露到热温度，会显著影响氧化指标，轻微影响抗氧化酶。脂类过氧化水平在开始的数个小时快速增加。在23℃驯化34～48 h后，谷胱甘肽过氧化物酶显著增加，同时谷胱甘肽s转化酶升至1.7倍[31]。金鱼超氧化物歧化酶（SOD）活性受到热休克的影响，在肝脏、脑、肾脏中增加，由热驯化导致新的分子合成与抗氧化防御上升[32]。

CAT活力在血液中的肝脏中的差异显示酶特性具有组织特异模式。翠鳢（Channa punctata）受温度胁迫，CAT只有肝脏中增加，推测对非生物因素应激反应的组织特异性有利于减少生理系统压力下对重要器官的生命活力功能紊乱损害[33]。

实验结果表明，0℃储藏下鲫鱼存活率较高：组Ⅰ存活8条，组Ⅱ存活9条，4℃储藏下两组均存活7条。低温驯化提高代谢酶活性对存活率影响仅在较低储藏温度即0℃组有差别，而0℃储藏下较高的存活率可能与其较高的抗氧化酶如肝CAT活力一致。

低温驯化有利于离水无氧储藏中的无氧代谢能力，降低血液氧化反应。使鱼类产生低温驯化而采取的降温措施为鲫鱼无水储藏保留了一定的有氧代谢能力。而氨基酸代谢、脑组织脂类过氧化主要受储藏温度的影响。

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Effect of Low Temperature Domestication Speed on the Enzyme Acitivity in the Waterless Storage of Crucian

ZENG Peng1， SHEN Jiang*2， CHEN Tianji1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.School of Mechanical Engineering，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

This work studied the impact of hyperthermia acclimation and storage temperature on waterless storage of live Crucian Carps.Crucian Carps were hyperthermia acclimated at the speed of 5℃/h and 1℃/h，and then cultured for 24 hours at 4℃and 0℃in waterless ice storage rooms to observe variations activity of metabolic enzyme and antioxidant enzyme.The results showed that the temperature adaption set as 1℃/h increased the activity of Lactate Dehydrogenase（LDH）.The activity of isocitrate dehydrogenase（IDH）was maintained comparatively well under such condition，while brain succinate dehydrogenas（SDH）didn't change.Alaninetraensaminase（ALT）activity was maintained at 0℃storage，and Malondialdehyde（MDA）acitivity was accumulated at 0℃.No obvious change was discovered in liver，which was caused by accumulated Catalase（CAT）low temperature storage.

malondialdehyde，mitochondrion amino acids，low temperature acclimation，amino acids

S 984.1

A

1673—1689（2015）08—0849—07

2014-04-11

高等学校博士学科点专项科研项目（20093104110004）。

*通信作者：申 江（1960—），男，河北邯郸人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事冷链技术与设备的研究。E-mail:shenjiang@tjcu.edu.cn