环糊精葡萄糖基转移酶使用性能改善的关键技术研究

环糊精葡萄糖基转移酶使用性能改善的关键技术研究

目前，环糊精的工业化生产采用酶法工艺，即淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶（EC 3.2.1.19，简称CGT酶）作用下通过环化反应合成环糊精。CGT酶生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差，这使产物的分离纯化很不方便。同时，CGT酶的另一缺陷是其热稳定性较差。由于在环糊精工业化生产中，底物淀粉首先要经过高温糊化、液化处理，然后降温至适当温度进行环化反应，若CGT酶能够适应更高的反应温度，势必有助于提高反应效率。改善CGT酶产物特异性和热稳定性，提高该酶的使用性能，将其应用于环糊精的工业化生产中，能显著降低环糊精的成本，促进环糊精在各个领域的广泛应用。

Goh,Poh Hong等 (2012)研究了环糊精葡萄糖基转移酶钙离子结合位点处的理性突变提高其热稳定性，构建了4种突变体——S182G、S182E、N132R和N28R。Leemhuis,H等 （2004）通过引入盐桥来提高来源于Bacillus circulans的CGT酶的热稳定性。Lee,SH等（2002）研究了CGT酶环化活力和热稳定性的调节及其作为保鲜酶的应用。为了降低其环化活力，将191和255位的苯丙氨酸分别被甘氨酸（F191G-CGTase ET1）和异亮氨酸（F255I-CGTase ET1）取代。两种突变体的最适温度均低于野生型酶，环化活力下降明显，但是相比于野生型酶，F255I-CGTase ET1的水解活力增加了2倍。Van Der Veen,BA等 （2000）研究了来源于Bacillus circulans strain 251的CGT酶中Arg47在环化和偶合反应中的作用——产物抑制和产物特异性。Yamamoto,T（2000）采用定点突变改变来源于Thermococcus sp B1001的CGT酶产物特异性，基于来源于Bacillus circulans no.8的CGT酶的底物结合模型，Tyr100，Trp191和Tyr267被确认参与定位直链淀粉螺旋结构并且通过糖类与芳烃的相互作用减少环糊精分子的大小，结果表明Tyr267对B1001来源的CGT酶催化产生α-环糊精起着非常重要的作用。

江南大学顾正彪教授课题组对改善环糊精葡萄糖基转移酶使用性能的关键技术进行了深入的研究。如，CN201310153421.3采用定点突变方法提高CGT酶的产β-环糊精能力，提供了提高Bacillus circulans STB01CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶中钙离子结合位点处第315位丙氨酸突变为精氨酸(Arg)或天冬氨酸(Asp)，获得突变体A315R和A315D。相比于野生CGT酶，这两种突变体具有更高的产β-环糊精能力，更适合β-环糊精的工业化生产。CN201410506112.4公开了一种受产物抑制减弱的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第599位的丙氨酸突变为天冬酰胺，得到单突变体A599N。CN201410169754.X公开了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法。该发明采用定点突变方法将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶的第577位天冬氨酸（Asp）分别突变为丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys），所得突变体相比于野生CGT酶，环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。CN200910029153.8利用蛋白质工程的定点突变方法提高一种环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)产β-环糊精能力，提供了提高来源于Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶的47位的Lys分别替换成Arg，His及Thr，获得的三种突变体酶K47R，K47H，K47T，它们的β-环糊精生产能力较野生型CGT酶有所提高；其中，突变体酶K47T尤为显著。CN201410050707.3通过纳米硅溶胶与聚乙二醇的协同添加显著提高酶的热稳定性，大大提高了酶的工业化应用价值。郑贤良等（2011）通过向重组α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)液中添加化学添加剂以提高其热稳定性及贮存稳定性.在不同温度下研究了添加剂对酶液的贮存稳定性影响,并用圆二色谱(CD)研究了CGT酶在近紫外区和远紫外区蛋白质结构与热稳定性的变化关系。

随着基因工程和分子生物学技术的不断发展，研究者已经开始对CGT酶进行遗传修饰，进一步研究该酶的特性及催化机制，从而有助于CGT酶催化效率及产物选择性的进一步提高。

（江南大学图书馆 张群）