庄河大骨鸡生长激素受体基因内含子2多态性的研究

谢明欣，许 红，毕 雪，朱弘焱，苏玉虹，田玉民

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

庄河大骨鸡生长激素受体基因内含子2多态性的研究

谢明欣，许 红，毕 雪，朱弘焱，苏玉虹，田玉民⋆

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

为研究庄河大骨鸡生长激素受体（GHR）基因内含子2特点，本试验从200只大骨鸡血液中提取DNA，PCR扩增GHR内含子2后进行HindⅢ酶切和琼脂糖凝胶电泳。研究结果表明，所选取的200只庄河大骨鸡GHR基因内含子2片段均能得到PCR扩增，产物大小为914 bp；扩增产物中具有2个HindⅢ酶切位点，均能获得3个酶切片段（529 bp、247 bp和138 bp），因此该酶切位点上无遗传多态性。

庄河大骨鸡；GHR基因；内含子2；内切酶H indⅢ

庄河大骨鸡主产于大连庄河市，是在特殊历史时期及特定的地理和气候条件下孕育出的独特地方品种。大骨鸡具有耐粗饲、耐寒及适应力强的特点，以体型大、胸深宽广、背宽而长、腿高粗壮、腹部丰满著称；所产鸡蛋具有蛋大壳红、营养丰富、味道鲜美的特色。随着大骨鸡消费市场的扩大，产业化进程加快，市场需求量日益增加。然而，与引进的专门化品种/品系相比，对其研究甚少，制约了产业化发展。虽然大骨鸡群体的生长速度较慢、饲料转化率较低，兼具产肉和产蛋性能但其中仍有相当的个体具有较高的生产性能。因此，研究大骨鸡遗传特点，对了解和开发大骨鸡具有重要意义。

据文献报道，影响鸡生长性状主要有生长激素及生长激素受体。生长激素（growth hormone,GH是影响动物3大物质代谢和生长发育的重要激素其发挥作用时必须要与细胞膜表面的受体结合即生长激素受体（growth hormone receptorGHR），然后通过细胞内的信号转导途径引起生理反应。GHR与促乳素受体、促红细胞生成素受体、白细胞介素受体属于同一家族，其结构特点是受体胞外的200多氨基酸具有显著的同源性，信号途径亦相似。鸡GHR基因的cDNA最早是由Burnside等[1]克隆和测序，发现GHR的cDNA全长为13 kb，具有9个外显子（缺少人类的外显子3），以单拷贝形式存在，共编码608个氨基酸（包括16个氨基酸的信号肽），与哺乳动物核苷酸序列同源性较低，为50%～58%。研究表明，GHR翻译的起始点位于内含子2上，内含子2的多态性与生长速度、产蛋量和产双黄蛋量有关。鉴于以往研究发现庄河大骨鸡GHR内含子2存在HindⅢ酶切位点，因此，本研究拟在获得产蛋数据基础上，通过分析庄河大骨鸡GHR基因片段特点，揭示GHR基因多态性与产蛋性能的相关性，为育种和遗传学研究提供参考和借鉴。净工作台、高速冷冻离心机、恒温水浴箱、PCR扩增仪、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、超纯水系统、-70℃超低温冰箱、微波炉等。

1.3 试验方法

1.3.1 大骨鸡血液基因组DNA提取及质量检测 取大骨鸡静脉血1 mL，用裂解液、蛋白酶K和SDS进行细胞裂解，用酚、氯仿和异戊醇提取基因组DNA。将提取的大骨鸡基因组DNA在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测DNA质量。

1.3.2 GHR PCR扩增的引物设计 根据NCBI鸡GHR基因序列，选择内含子2为扩增靶片段，利用软件PRIMER 5.0设计引物如下：上游引物(F)：5'agt tctatcagtaggcagtaa 3'下游引物(R)：5'at tcaatctatgctcct tcacaaaa 3'

根据GHR基因序列，利用Primer 5.0分析可知上述扩增片段内含有内切酶HindⅢ酶切位点。

1.3.3 大骨鸡GRH基因片段PCR扩增 PCR扩增的反应体系如表1。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，51.8℃退火45 s，72℃延伸45 s；30～35个循环，最后72℃延伸10 min用1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，DNA分子量标准品是Marker 2000，紫外灯下观察并照相。

1.3.4 PCR扩增产物的酶切 限制性内切酶HindⅢ的酶切反应体系如表2。酶切条件为37℃，3～4 h。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选用辽宁医学院畜牧兽医学院科研团队养殖的庄河大骨鸡，随机挑选200只健康雌鸡单笼饲养于同一鸡舍，管理条件完全相同，日粮参照美国NRC营养标准。

1.2 试验仪器与试剂 蛋白酶K、琼脂糖、DL2000 Marker限制性内切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均购自大连宝生物工程有限公司；其他均为分析纯试剂。试验仪器均为国产或进口设备，如超

表1 大骨鸡GRH基因内含子2 PCR扩增反应体系Tab le1 PCR reaction system for GHR intron 2 of Zhuanghe Dagu chicken

1.3.5 PCR产物酶切后电泳 用1%的琼脂糖凝胶进行酶切产物的电泳，DNA分子量标准品是Marker 2000，紫外灯下观察并照相。

2 结果与分析

2.1 大骨鸡血液基因组DNA质量检测 大骨鸡血液DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1 大骨鸡血液基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA for blood samp les of Zhuanghe Dagu chicken

图1可见大分子量的DNA条带，为基因组DNA。

2.2 大骨鸡GHR基因内含子2 PCR扩增结果 采用作者设计的引物，PCR扩增大骨鸡GHR基因内含子2的部分片段，其琼脂糖凝胶电泳结果见图2。

图2 大骨鸡GRH基因内含子2 PCR产物凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR of GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

由图2可见，PCR产物大小约为910 bp，符合预期的扩增长度，可以用来进行RFLP分析。

2.3 PCR产物HindⅢ酶切结果 本试验所设计的PCR上下游引物间的具有两个HindⅢ酶切位点，因此，大骨鸡GRH基因内含子2 PCR产物酶切后电泳结果见图3，条带大小为529 bp、247 bp和138 bp。在本试验所检测的200个体中仅出现上述一种带型，所以本试验所采样的大骨鸡GHR基因内含子2片段没有多态性。

3 讨论与结论

研究表明，GHR基因多态性与来航鸡的早期体重、蛋鸡开产至273日龄产蛋量相关[2]。Hocking等[3]研究发现GHR作为候选基因与鸡产蛋性能、双黄蛋数有关，Kuhnlein等[4]报道了GHR基因多态性与鸡产蛋数相关。而Nagaraja等[5]的研究结果进一步验证了 GHR基因与鸡产蛋数相关。国内的葛洪伟等[6]在文昌鸡GHR基因内含子2发现了多态性，并证实该多态性与产蛋性状中的双黄蛋产量呈显著相关。徐文娟等[7]在文昌鸡GHR基因内含子5中检测到多态性并证明其多态性与蛋壳厚度显著相关。裴勤贤[8]对兴义矮脚鸡公鸡进行GHR基因内含子2研究发现，其多态性与公鸡各周龄体重相关显著，与母鸡体重相关不显著。此外，王洪才等[9]发现GHR基因内含子2序列存在较丰富的多态性，其多态性对庄河大骨鸡的产肉性能存在一定的影响。国内其他学者对GHR基因与生长性能之间的关系及遗传多样性也做了一些研究[10-11]。

本试验所扩增的是GHR基因内含子2的部分片段，在200余只庄河大骨鸡中仅检测到一种Hind III酶切类型，即2个酶切位点3个片段，没有出现该位点的多态性。虽然国内其他学者的研究中存在GHR多态性[9]，可能的原因有：①确实不存在多态性；②多态性基因型频率低，受200只母鸡样本的限制，未检测到多态性个体；③所扩增的GHR基因片段不同，导致结果不同。为更确切探明庄河大骨鸡GHR基因内含子2是否存在多态性位点，项目组拟进一步测序分析。

GHR作为影响动物体生长的关键成分，GHR基因结构变异可能导致蛋白结构和功能的改变，进而影响与GH的结合，导致生长速度降低。自1992年以来，已有较多的关于鸡GHR结构、多态性和功能的研究，但还有很多功能尚不清楚，如多态性与功能的关系、细胞内信号传递机制等。因此，需要围绕鸡的GHR进行深入地研究，以便为调控家禽生长性能、产蛋性能的分子标记辅助选择奠定基础。

图3 大骨鸡GRH基因内含子2 PCR产物酶切后凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of enzym e digestion for PCR p roducts o f GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

[1]Burnside J,Liou S S,Zhong C,et al.Abnormal growth hormone receptor gene expression in the Sex-l inked dwar f chicken[J].Endocrinol,1992,88(1):20-28.

[2]Feng X P,Kuhnlein U,Faithful l R W,et al.A genetic marker in the growth hormone receptor gene associated with body weight in chickens[J].J Hered,1998,89(4):355-359.

[3]Hocking P M,Bernard R,Wi lkie R S,et al. Plasma growth hormone and insul in-l ike growth factor-I(IGF-I)concent rations at th onset of lay in ad l ibitum and restricte broiler breeder fowl[J].Br Poul t Sci,1994 35:299-308.

[4]Kuhnlein U,Ni L,Weigend S,et al.DNA poly morphisms in the chicken growth hormon gene:response to selection for disease re sistance and association with egg productio [J].Anim Genet,1997,28:116-123.

[5]Nagaraja S C,Aggrey S E,Yao J,et al.Trai association of a genetic marker near the IGF I gene in egg-laying chickens[J]. Hered 2000,91:150-156.

[6]葛洪伟，李碧春，李慧芳，等.文昌鸡GHR基因内含子和5位点对文昌鸡繁殖性能的遗传效应研究[J].中国畜牧杂志，2007，43（19）：8-10.

[7]徐文娟，李亨，朱文奇，等.GHR、IGH-1基因多态性对文昌鸡蛋品质性状遗传效应的研究[J].中国畜牧杂志2008，44（17）：1-3.

[8]裴勤贤.鸡GH基因和GHR基因多态性与早期生长性能的相关性研究[D].贵阳：贵州大学，2007.

[9]王洪才，袁晓春，宋天玉.庄河大骨鸡GHR基因的多态性及其与产肉性能的关联分析[J].中国家禽，2012 34（18）：29-32.

[10]夏祖和，陈清.禽类生长激素受体基因研究进展[J]金陵科技学院学报，2009，25（2）：78-81.

[11]杨志勤，宋悦，竭航，等.家鸡生长激素受体基因外显子10多态性分析[J].中国畜牧杂志，2013，49（15）12-15.

Study on Polymorphism Grow th Hormone Receptor intron 2 in Zhuanghe Dagu Chicken

Xie Mingxin,Xu Hong,Bi Xue,Zhu Hongyan,Su Yuhong,Tian Yumin*
（Col lege of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001）

In order to study the characteristics of growth hormone receptor(GHR)int ron 2 for Zhuanghe Dagu chicken,DNA were ext racted f rom 200 blood samples of Zhuanghe Dagu chicken and ampl ifed by PCR with primers of GHR int ron 2.The PCR products were digested with enzyme HindⅢand then displayed by agarose gel elect rophoresis.The resul ts showed that al l GHR int ron 2 in 200 samples were ampl i fed by PCR with products of 914 bp.Al l samples showed two enzyme sites of HindⅢ among the product and three f ragments of 529 bp,247 bp and 138 bp in agarose gel.Therefore,there was no Genetic polymorphism.

Zhuanghe Dagu chicken;GHR gene;Intron 2;Enzyme HindⅢ

S831

1672-9692(2015)05-0034-04

2015-04-05

谢明欣（1992-），女，动物科学专业在读。

田玉民（1962-），男，教授，硕士生导师，研究方向为饲料资源开发与利用。

辽宁省大学生创新课题（201410160016）、辽宁省科技厅计划项目（2014209006）及辽宁医学院领军人物资助项目