同位素内标法测定饲料中氢溴酸常山酮——超高效液相色谱-串联质谱法

王丽娜，王 姝，田晓玲，刘 凯

（1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁省食品药品监督管理局行政服务中心，辽宁 沈阳 110016）

同位素内标法测定饲料中氢溴酸常山酮
——超高效液相色谱-串联质谱法

王丽娜1，王 姝2，田晓玲1，刘 凯1

（1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁省食品药品监督管理局行政服务中心，辽宁 沈阳 110016）

本研究建立了饲料中氢溴酸常山酮的UPLC-MS/MS分析方法。样品经乙腈提取，离心后经正己烷除脂净化，氮气吹干后，50%甲醇溶液复溶，UPLC-MS/MS分析。结果表明，氢溴酸常山酮在20.0～500.0μg/L浓度范围内线性关系良好，r2=0.999 1。以浓缩饲料、配合饲料、预混料为添加基质，其回收率在60%～120%，检出限为25.0 μg/kg，定量限为50.0μg/kg。结论显示，本方法灵敏度高，专属性好，操作简单，结果可靠，可满足饲料中氢溴酸常山酮的分析检测。

氢溴酸常山酮；饲料；UPLC-MS/MS

氢溴酸常山酮是由一种植物常山（Dichroa fabrifuga）中获得的喹唑酮类物质，常山酮为较新型的广谱抗球虫药。在国内氢溴酸常山酮被允许以3 mg/kg的浓度添加到饲料里，休药期为4 d。目前，检测氢溴酸常山酮的方法主要采用液相色谱法、液相色谱-质谱法[1]，目前关于检测饲料中氢溴酸常山酮残留量的报道较少。本文采用超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中氢溴酸常山酮含量能够克服背景干扰，提高信噪比，能够准确定性和定量

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相色谱串联质谱仪、氮吹仪（Heros RS-2）、高速离心机（Biofuge STRATOS Centri fuge），Mi ll iQ超纯水器（美国Mil l ipore公司）。

1.1.2 对照品 氢溴酸常山酮、氢溴酸常山酮-13C6（对照品均来源于Adlershof GmbH公司），纯度≥95.0%。

1.1.3 对照品溶液的配制 分别精密称取氢溴酸常山酮、氢溴酸常山酮-13C6对照品，以50%乙腈水溶液为溶剂配成浓度各约1 mg/mL标准储备液，2～8℃冷藏保存。准确吸取适量上述标准储备液，用50%乙腈水溶液稀释成浓度为1μg/mL对照品中间液。

1.1.4 试剂 乙腈（色谱纯）；正己烷（分析纯）；甲酸（色谱纯，纯度为99%）；甲醇（色谱纯）。试验用水均为超纯水。

1.2 样品前处理 称取饲料样品2 g（准确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入1μg/mL内标工作液100μL（应明确内标工作液的配制方法及浓度)，加入乙腈20 mL，涡旋60 s，10 000 r/min离心5 min，上清液转移至另一离心管中。加入5 m正己烷，涡旋30 s，10 000 r/min离心5 min。弃去上层，下层溶液50℃氮气吹干。2 mL 50%甲醇溶液溶解后，加入5 mL正己烷，涡旋30 s，10 00 r/min离心5 min。弃去上层，下层过0.22μm滤膜过滤，上机测定。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件 C18100 mm×2.1 mm，粒径1. μm。或其他效果等同的C18柱；柱温40℃，流动相流速为0.3 mL/min，流动相：A：甲醇；B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～1 min，维持5%A，1～3 min A线性变化至95%，3.5～5 min，维持5%A。

1.3.2 质谱条件 电喷雾正离子扫描（ESI+），毛细管电压3.0 KV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流速650 L/h，锥孔锥孔气流速50 L/h，碰撞气为高纯氩气，光电倍增管电压650 V。采用MRM多反应监测方式，母离子（Q1）/子离子（Q3）离子对见表1。

表1 目标化合物的UPLC-MS/MS检测条件Tab le1 UPLC-MS/MS acquisition param eters for target com pounds

2 结果与分析

2.1 母离子和子离子的选择 以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相[2]，采用MS-Scan模式进行全扫描，确定母离子质量数，优化母离子使其获得较高的丰度。选定母离子后再采用Daughter-Scan方式对其子离子进行扫描，通过优化碰撞能量选择两个丰度较高的子离子作为定性和定量离子。利巴韦林药物的离子对、锥孔电压及碰撞能量的优化参数见表1。

根据欧盟2002/657/EC要求，确证利巴韦林至少需要4个识别点（IP），分别选择了母离子以及对应的2个响应较强的子离子作为定性定量依据，这样1个母离子1个IP点，对应2个子离子分别1.5个IP点，达到了4个IP点，很好地满足了欧盟有关法规的要求。

2.2 液相色谱优化条件的选择 氢溴酸常山酮中等极性，容易在反相C18色谱柱上保留[3]。以甲醇和0.1%甲酸水溶液作流动相，在流速为0.3 mL/min的条件下，根据实验室条件选用Waters BEH C18、Wa ters HSS T3、Agilent SB-Aq色谱柱，其测得的结果是，氢溴酸常山酮在Agi lent SB-Aq色谱柱中的保留性差，保留时间短。在Waters BEH C18和Waters HSS T3色谱柱中保留性好，能够有效避免药物在死时间出峰，保留时间理想。流动相以0.1%甲酸水为强洗溶剂，以甲醇为弱洗溶剂[4]，减少水相可缩短保留时间，但甲醇可提高质谱检测的灵敏度。在流动相中加入甲酸可以提高被检测药物的离子化效率，提高灵敏度。故试验选择1.3.1为试验液相条件。

2.3 样品前处理条件的确定 氢溴酸常山酮药物的提取剂在参考相关文献的基础上选择使用甲醇、乙腈2种提取液的提取效果[5]，根据添加50μg/kg的样品回收结果，表明乙腈为提取溶剂时提取回收率高，杂质干扰小。

2.4 线性方程、检出限和定量限 分别精密量取适量1μg/mL的氢溴酸常山酮及内标溶液，制得浓度为20、50、100、200、500 ng/mL系列对照溶液供高效液相色谱-串联质谱法测定。以对照品和内标物色谱峰面积的比值为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。曲线方程见表2。

表2 目标化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Tab le2 Calibration curves，corre lation coefficient、LOD and LOQ o f target com pounds

2.5 方法的灵敏度 空白试料按相同的步骤处理后，测定结果表明：在相应的保留时间，空白试料对所测分析物无干扰。

图1 配合饲料定量限图谱Fig.1 Chromatogram s o f ribavirin spiked at the leve l of LOQ in feeds

检测限（LOD）与定量限（LOQ）：添加适量混合标准溶液于2g空白样品中，经提取净化后测定，根据所测药物的S/N＞3（按PtP算）计算氢溴酸常山酮在配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中检出限为25μg/kg，S/N＞10（按PtP算）计算氢溴酸常山酮在配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中定量限50μg/kg，见图1～3。

图2 浓缩料定量限图谱Fig.2 Chromatograms of ribavirin spiked at the level of LOQ in concentrated feeds

图3 预混合饲料定量限图谱Fig.3 Chrom atogram s of Halofuginone spiked at the leve l of LOD in Pre-m ixed feeds feeds

20μg/L标准溶液在MRM监测模式下的选择离子流图，见图4。

图4 20μg/m L氢溴酸常山酮对照品溶液图谱Fig.4 Chrom atogram s of 20μg/m L Halofuginone standards so lution

2.6 方法回收率和精密度考察 由于氢溴酸常山酮在产蛋期饲料中禁止使用，作为药物饲料添加剂用量为3 mg/kg。采用标准添加法，在空白饲料中（产蛋期）添加浓度50～250μg/kg，在普通饲料中添加浓度为1.5～6 mg/kg的水平范围内进行回收率试验，各浓度5个样品平行试验，平均回收率为60.0%～120%，批内批间RSD值均＜20%。计算结果见表3～8。

表3 空白预混合饲料（产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTable3 Results o f recovery experim ents and RSD in Pre-m ixed feeds（egg laying period）（n=5）

表4 空白浓缩饲料（产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTable4 Results of recovery experiments and RSD in concentrated feeds（egg laying period）（n=5）

表5 空白配合饲料（产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab le5 Results of recovery experim ents and RSD in feeds（egg laying period）（n=5）

表6 空白预混合饲料（非产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab le6 Resu lts of recovery experim ents and RSD in pre-m ixedd feeds（n=5）

表7 空白浓缩饲料（非产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab le7 Resu lts o f recovery experim ents and RSD in concentrated feeds（n=5）

表8 空白配合饲料（非产蛋期）中添加药物后得到的回收率及批内批间RSDTab le8 Results of recovery experiments and RSD in feeds(n=5)

3 结论

本研究建立了一种定性与定量测定配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中氢溴酸常山酮残留量的分析方法。此方法稳定性强，重现性好，能够满足配合饲料、浓缩料、预混合饲料中氢溴酸常山酮的确证检测。

[1]李丹，孙雷，毕言峰，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉和牛肉中五种常用抗球虫药[J].中国兽药杂志，2013，47（4）：38-41.

[2]曹莹，黄士新，沈富林，等.高效液相色谱法测定鸡肝组织中的氢溴酸常山酮残留[J].中国兽药杂志2004，38（4）：11-13.

[3]候亚莉，汤明，郭利敏，等.鲟鱼肌肉中氢溴酸常山酮残留检测的高效液相色谱法[J].中国兽药杂志2006，40（5）：15-18.

[4]吴宁鹏，杜向党，沈建忠.鸡肝脏和肌肉组织中常山酮残留的ELISA检测[J].畜牧兽医学报，2006，37（6）597-602.

[5]李银生，王秀红.液相色谱串联质谱法同时测定鸡肉或鸡蛋中常见抗球虫类药物残留[J].上海交通大学学报（农业科学版），2011，29（6）：16-23.

Determ ination of Halofuginone in Feeds by Ultra Perform ance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wang Lina1,Wang Shu2,Tian Xiaol ing1,Liu Kai1
(1.Animal feed qual ity and safety of venterinary testing centre in Liaoning province,Liaoning Shenyang
110016；2.Liaoningprovincial foodandDrugAdminist rationAdminist rativeServiceCenter,Liaoning Shenyang 110016）

Amethod of Ul tra Per formance Liquid Chromatography-Tandem mass spect romet ry(UPLC-MS/ MS)for determination of Halofuginone in feeds was developed.The samples were extracted with acetonit ri le,cent ri fugated and then degreasing purif ied with n-hexane,dried with nitrogen,dissolved again using 50%methanol solution.Af ter UPLC-MS/MS,the resul ts shows that the l inear relationship is good(r2=0.999 1)when hydrobromic acid Changshan ketone concent ration range is at 20～500μg/L.As the added mat rix with concent rated feed,feed,premix,the recovery rate is 60%～120%,the detection l imit is 25μg/kg,the l imit of quanti f ication is 50μg/kg.Conclusion:this method has the advantages of high sensitivity,good speci ficity,simple operation,reliable resul ts,which can meet the detection and analysis of Halofuginone analysis in feed.

Halofuginone;Feeds;UPLC/MS/MS

S812.6

1672-9692(2015)05-0012-07

2015-03-24

王丽娜（1982-），女，硕士研究生，主要从事兽药残留检测工作。