H 3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析

李岩

（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江 青冈 151600）

H 3亚型鸭源流感病毒分离鉴定及HA基因序列分析

李岩

（黑龙江省绥化市青冈县畜牧兽医局，黑龙江 青冈 151600）

为了研究H 3亚型禽流感病毒的分子特征，本研究从鸭的粪便样本中分离到一株禽流感病毒，通过血凝抑制试验证实该分离株为H3亚型流感病毒，命名为A/Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N 2)。对其血凝素基因进行了克隆和序列分析，结果表明分离株与韩国水鸟的H3N 2亚型AIV A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高，达到94.6%。系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟。本研究为H 3亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据。

鸭；流感病毒；H 3亚型；HA基因；序列分析

禽流感（Avian inf luenza,AI）是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒（Avian inf luenza virus,AIV）所引起的禽类传染病。该病广泛流行于世界各地，给养禽业乃至人类造成了巨大的威胁和经济损失。根据AIV的血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶可将其分为16个HA亚型和9个NA亚型[1]。目前，我国禽群中常见的亚型主要有H3、H5、H6、和H9[2-3]，其中H5为高致病性亚型，其他亚型均为低致病性禽流感病毒。水禽是流感病毒的自然宿主和基因储存库，水禽在流感病毒的进化中发挥重要作用。H3亚型流感病毒感染的宿主谱比较广泛，包括禽、猪、人、犬马、猫等[4-8]。1989年，我国马群中暴发禽源H3N亚型流感病毒，造成严重的经济影响。自2006年以来，韩国和中国等地频繁发生禽源H3N2亚型流感病毒感染犬的事件[8-9]。这些证据表明，虽然H3亚型AIV在禽中为低致病性的，但跨种传播后感染性增强，危害严重。因此，有必要加强H3亚型AIV的流行病学调查。本研究中，笔者在进行常规的流行病学调查时从临床健康鸭中分离到一株H3N2亚型AIV，并对其HA基因进行了序列分析，报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和拭子 AMV Reverse Transcriptase、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自大连宝生物工程公司；Trizol Reagent、RNase Inhibitor购自Invit rogen公司；AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自康宁生命科学（吴江）有限公司。流感病毒H3、H5、H9和鸡新城疫（Newcast le disease, ND）标准阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司。鸭泄殖腔棉拭子采自黑龙江省青冈县某养殖户的家鸭。

1.2 病毒分离及亚型鉴定 鸭泄殖腔棉拭子液按常规方法处理，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵化48 h后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，将具有血凝价的鸡胚尿囊液先与ND标准阳性血清进行血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验，ND HI试验阴性的鸡胚尿囊液再与AIV H3、H5、H9标准阳性血清进行HI试验，具体操作程序与判断标准按文献进行[10]。将鉴定为阳性的病毒分装，保存于-20℃备用。

1.3 引物设计 根据GenBank中H3亚型AIV HA基因的核苷酸序列，应用Primer 5.0软件设计引物，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。反转录引物序列Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因特异性PCR引物序列：HA-F:5’-AGCAAAAGCAGGGGATACCTGC-3’，HA-R:5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTGTAATTATC-3’。

1.4 病毒提取及cDNA的制备 参考AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书提取尿囊液中病毒RNA。然后参考AMV Reverse Transcriptase说明书，用Uni12反转录引物进行反转录，合成cDNA[11]。

1.5 HA基因扩增及序列分析 以上述制备的cDN为模板，用HA基因特异性引物HA-F和HA-R进行PCR扩增[11]，随后用1%琼脂糖凝胶进行电泳。产物纯化后连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆进行测序。下载H3亚型AIV参考毒株HA基因序列，用DNAStar程序中的MegAl ign软件进行同源性比对用MEGA 5.0软件中的邻接法构建系统发育树。

2 结果和分析

2.1 病毒的分离及鉴定 病料接种鸡胚后收集的尿囊液能够凝集鸡红细胞，血凝价能够达到29ND、H5和H9 AI阳性血清均不能够对该尿囊液产生抑制作用，而H3亚型AI标准阳性血清能够产生很高的抑制作用，血凝抑制效价达到9log2，从而表明该尿囊液含有H3亚型AIV。命名为A/Duck/Hei longj iang/1/2014（H3N2）。

2.2 HA基因的PCR扩增 用H3亚型AIV HA基因特异性引物对尿囊液中提取的RNA进行RT-PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，可见在1 76 bp处出现特异性条带，与预期结果相符，见图1。

图1 HA基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR product of HA gene

2.3 HA序列分析 测序结果表明，HA基因全长1 765 nt，编码区长1 701 nt，位于30～1 730 nt共编码566个氨基酸。对HA基因编码区核酸序列分析表明，分离株A/Duck/Hei longjiang/1/2014（H3N2与参考株A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005（H3N2的同源性最高，为94.6%，而氨基酸序列同源性最高 的 毒 株 为 A/pigeon/Nanchang/9-058/2000（H3N3），达到97.3%。氨基酸序列进一步分析表明HA蛋白共有6个潜在的N糖基化位点，分别为NNT（8位）、NGT（22位）、NAT（38位）、NVT（165位）、NGS（285位）和NGT（483位），与A/Duck/Ukraine/1/ 63(H3N8)比较，在81位缺少一个糖基化位点。抗原位点分析发现，与A/Duck/Ukraine/1963(H3N8相比，分离株的抗原决定簇A、B和C区的氨基酸位点均发生一定程度的改变；受体结合位点226及228位均为Q和G[12]（见表1）。HA裂解位点均为PE KQTRGLF[13]。

表1 HA抗原及受体结合位点的差异比较Table1 Comparison of antigenic sites and receptor binding sites o f HA

2.4 HA基因系统发育树构建 根据分离株A/ Duck/Heilongjiang/1/2014(H3N2)的HA基因核酸序列构建系统发育树（见图2）。结果表明，分离株与A/pigeon/Nanchang/9-058/2000(H3N3)亲缘关系最近，与韩国株共处于同一进化分支内，与最早的禽源H3亚型AIV A/duck/Ukraine/1963(H3N8)处于不同的进化分支。

3 讨论

H3亚型AIV对禽来讲虽然是低致病性的，但跨种传播后常导致严重的危害。目前已有确凿证据表明H3亚型AIV能够跨越种间屏障感染猪、马、犬和猫等多种哺乳动物[2-7]。本研究从无临床症状的家鸭体内分离到一株AIV，经血凝试验和血凝抑制试验证实该分离株为一株H3亚型AIV。HA基因分析表明分离株与分离于韩国水鸟的H3N2亚型AIV A aquatic bird/Korea/KN-2/2005的同源性最高，系统发育树分析进一步证实分离株可能来源于韩国的水鸟。同时，分析发现，分离株在多个抗原位点上与最早分离株A/Duck/Ukraine/1963(H3N8)均有明显差异，表明其已经发生明显的抗原变异，以适应环境和宿主的压力。HA裂解位点为PEKQTRGLF，表明其是一株低致病性AIV。

图2 HA基因的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene

家鸭是流感的自然储存宿主，多种亚型AIV在鸭中均能分离到，因此，家鸭在AI的流行中扮演重要角色。H3亚型AIV是家鸭中普遍存在的低致病性流感亚型，但其能够为其他不同亚型流感病毒的重组提供基因片段[14]，可能导致新的具有高致病性毒株的出现，从而造成流感暴发，因此，开展H3亚型低致病性AIV的流行病学调查具有重要的理论和实践意义。

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Isolation，identification ofH3 subtype influenza virus originated from duck and analysis of HA gene

Li Yan
（Animalhusbandryandveter inarybureauofQinggang,Hei longj iang Qinggang 151600）

To investigate the molecular characteristics of H3 subtype avian inf luenza virus, the isolation of viruses f rom duck fecal samples was conducted.A H3 subtype avian inf luenza virus A/Duck/Hei longj iang/1/2014 (H3N2) was isolated and identif ied by hemagglutination inhibition tests.The hemagglutinin gene was cloned and analyzed.The resul ts showed that the isolation virus was closely related to the A/aquatic bird/Korea/KN-2/2005 with the highest homology of 94.6%.Phylogenetic t ree analysis further conf irmed that the isolation virus may derive f rom water birds f rom South Korea.The present research has added new data for the H3 subtype of avian inf luenza epidemiological studies.

Duck;Inf luenza virus;H3 subtype;HA gene;Sequence analysis

S855.3

1672-9692(2015)05-0007-05

2015-02-25

李岩（1974-），男，本科，高级兽医师，兽医站长，从事畜牧兽医技术推广和动物疾病诊疗工作。