经不同途径区域灌注氟尿嘧啶在肝癌、肝组织及血浆中的浓度差异

郑惊雷，梁力建，王在国，黄文静，王雪丁

1.广东省东莞市人民医院肿瘤外科，广东 东莞 523059；

2.中山大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510080；

3.广东省药品检验所抗生素室，广东 广州 510180；

4.中山大学药学院，广东 广州510080

经不同途径区域灌注氟尿嘧啶在肝癌、肝组织及血浆中的浓度差异

郑惊雷1，梁力建2，王在国1，黄文静3，王雪丁4

1.广东省东莞市人民医院肿瘤外科，广东 东莞 523059；

2.中山大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510080；

3.广东省药品检验所抗生素室，广东 广州 510180；

4.中山大学药学院，广东 广州510080

背景与目的：肝动脉、肝门静脉灌注区域化疗是肝癌的重要治疗手段，本研究探讨区域性灌注化疗时氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)在大鼠肝癌和肝脏组织及血浆中的分布，为临床肝脏肿瘤化疗提供参考。方法：将24只荷瘤大鼠随机分为4组，分别经外周静脉(尾静脉)、肝动脉、肝门静脉或结扎肝动脉后经肝门静脉灌注5-FU，剂量为20 mg/kg。采用高效液相色谱法测定肝癌、肝脏组织及血浆中5-FU的含量，并计算药物在血浆、肝脏和肝癌组织间的穿透比率。结果：结扎肝动脉的肝门静脉组5-FU浓度在肝脏和肝癌组织中最高，分别为(22.1±9.5)μg/g和(16.4±7.2)μg/g；其次为肝动脉组；肝门静脉组5-FU浓度在肝癌组织中的浓度较低，为(8.9±3.7)μg/g；外周静脉组5-FU浓度在肝脏和肝癌组织中的药物浓度均为最低，肝癌组织中的浓度仅为(4.3±2.2)μg/g。在血浆中的5-FU浓度正好相反，外周静脉组浓度最高(26.8±12.5)μg/mL，肝动脉组(16.4±9.7)μg/mL、结扎肝动脉的肝门静脉组(15.9±10.1)μg/mL和肝门静脉组(14.9±8.5)μg/mL等3组浓度相近，均明显低于外周静脉组(P<0.05)。5-FU的肝癌/血浆穿透比率依次为结扎肝动脉的肝门静脉组(103.47%)，肝动脉组(92.94%)，肝门静脉组(59.58%)和外周静脉组(16.08%)。结论：与外周静脉注射全身化疗比较，区域性灌注化疗可显著提高肝癌和肝脏组织中的药物浓度，同时减少化疗药物在外周血中的分布，其中经结扎肝动脉的肝门静脉灌注和经肝动脉灌注是肝癌区域性化疗2种较好的途径。

氟尿嘧啶；肝癌；区域化疗；穿透比率

肝癌全身化疗效果不理想，有效率不足20%。肝动脉和(或)肝门静脉灌注区域化疗常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手段，以实现药物在癌灶和靶组织器官中达到高浓度，并减少外周血和其它组织器官中药物分布、降低不良反应的目的［1-2］。本研究在既往研究［3］的基础上，进一步研究和比较分别在外周静脉注射和不同途径的区域性灌注下，肝癌和肝脏组织及血浆中的药物分布规律和差异，探讨区域性灌注化疗对肝癌的化学治疗作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性BALB/c裸鼠2只，体质量17.1～19.6 g，作种鼠供皮下接种肿瘤细胞株用，雄性Wistar大鼠24只，体质量(120±15) g，供肝内种植肿瘤用；均为SPF级，由中山大学动物中心提供。动物实验过程严格按动物伦理规范进行。

1.1.2 肿瘤细胞株

大鼠CBRH-7919肝癌细胞株，由中山大学细胞保藏中心提供。

1.1.3 药品

氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)，南通精华制药有限公司生产，批号：070402，规格10 mL： 0.25 g。5-FU对照品：南通精华制药有限公司提供，批号：02005098。

1.1.4 仪器

Waters高效液相色谱系统：Waters 486紫外检测器，Waters 510泵，SCL进样器，三锐色谱工作站；XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；飞鸽TGL-16C台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；微量采样器(上海求精生化试剂厂)；0.45μm微孔滤膜(天津腾达过滤器件厂)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠移植性肝癌模型的建立

参照程文等［4］的方法并加以改进，将培养好的CBRH-7919肝癌细胞悬液在无菌条件下注射于2只裸小鼠背部皮下，每只注射0.2 mL (约5×106个细胞)。2周后长成直径1.5 cm大小的肿瘤，麻醉后在无菌条件下取出肿瘤，选择边缘的乳白色癌组织，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤块。大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛0.3 mg/100 g腹腔注射麻醉后固定，消毒后在无菌条件下取剑突下正中切口打开腹腔。选择肝左叶，以穿刺针在肝包膜下斜形作一深约8 mm的隧道，将预先装在针芯内的瘤块缓慢推出植入肝内，用小块明胶海绵封闭创口。手术当天始连续5 d腹腔注射氢化可的松2 mg/只抑制免疫。

1.2.2 实验分组及给药

造模2周后，将荷瘤大鼠24只用简单随机抽样法分为4组，每组6只。①外周静脉组：经尾静脉注射给药；②肝动脉组：经胃十二指肠动脉插管至肝动脉给药；③肝门静脉组：经胃网膜静脉插管至肝门静脉给药；④肝动脉结扎的肝门静脉组：先行肝动脉结扎后经肝门静脉给药。大鼠的5-FU给药剂量为20 mg/kg体质量。

1.2.3 肝动脉和门静脉插管方法

肝动脉组大鼠开腹后，分离出胃十二指肠动脉、肝总动脉及肝固有动脉。用动脉夹暂时阻断肝总动脉，在胃十二指肠动脉远端插入外径约0.5 mm的自制导管到肝固有动脉开口处，确认管腔通畅后(松开动脉夹，可以看到导管内血液波动)，前端用已经套好的丝线结扎并固定，按体质量注入稀释于0.9%NaCl溶液的5-FU注射液后结扎胃十二指肠动脉。同法，对肝门静脉组大鼠行胃网膜静脉插管经肠系膜上静脉至肝门静脉给药。

1.2.4 标本采集

大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，按上述不同途径注射5-FU，给药后10 min经下腔静脉取血2 mL，置于已肝素化的聚乙烯塑料管，1 400×g离心20 min取血浆，-20 ℃低温保存；同时剥离肝脏肿瘤并切取癌旁肝脏组织约2 g，用0.9%NaCl溶液清洗后，置于玻璃研钵中研磨成匀浆，-20 ℃低温保存，备用。

1.2.5 测定5-FU浓度［5］

采用高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠血浆、肝癌和肝脏组织中5-FU的浓度。①标本处理：取0.2 mL血浆或全部肝脏(或肿瘤)组织匀浆，加1 mL乙酰乙酯旋涡振荡5 min，5 600×g离心10 min，吸取上清液于试管中，用氮气吹干。残留物用100 μL流动相溶解，取20 μL进样测定；②HPLC色谱条件：色谱柱为Kromasil 100A C18柱(5 μ，250 mm×4.6 mm，迪马公司)；流动相为0.01 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液、流速为1 mL/min；紫外检测波长为265 nm；进样量20 μL。使用三锐色谱工作软件记录色谱峰，自动计算峰面积；③制作标准曲线：分别取大鼠空白血浆0.2 mL或2 g空白肝脏的匀浆液，加入不同浓度的5-FU标准溶液，重复上述方法测定，以相应的药物浓度对色谱峰面积进行线性回归，得血浆和肝脏组织的标准曲线回归方程。

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。①不同给药途径下5-FU区域灌注化疗时肝癌、癌旁肝脏组织和血浆中的药物浓度分布数据用±s表示。各组之间计量资料比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义；②计算穿透比率(PR)：PRLP=CL/CP，PRCP=CC/CP，PRCL=CC/ CL；PRLP为化疗药物在肝脏-血浆的穿透比率，PRCP为肝癌-血浆的穿透比率，PRCL为肝癌-肝脏组织的穿透比率；CP为血浆药物浓度，CL为肝脏组织药物浓度，CC为肝癌组织药物浓度。

2 结 果

2.1 药物在肝癌、癌旁肝脏组织和血浆中的浓度分布

大鼠经不同途径灌注化疗药物5-FU后，药物在肝癌、癌旁肝脏组织和血浆中的分布具有显著的差异。外周静脉组的血浆5-FU浓度最高，达(26.8±12.5)μg/mL，而癌旁肝脏组织和肝癌中的药物浓度均为最低，癌灶中的浓度仅为(4.3±2.2)μg/g。结扎肝动脉的肝门静脉组的药物浓度在癌旁肝脏组织和肝癌中最高，分别为(22.1±9.5)μg/g和(16.4±7.2)μg/g；其次为肝动脉组，癌旁肝脏组织和肝癌中的浓度均稍低于前者；肝门静脉组在肝癌中的浓度较低，为(8.9±3.7)μg/g。5-FU在上述3组中的血浆浓度分别为(15.9±10.1)，(16.4±9.7)和(14.9±8.5) μg/mL，均显著低于外周静脉组，而3组之间的血药浓度差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.2 5-FU经不同途径灌注给药后的穿透比率

经不同途径灌注5-FU后，结扎肝动脉的肝门静脉组的穿透比率最高，药物在肝脏/血浆、肝癌/血浆和肝癌/肝脏间的穿透比率分别为139.19%、103.47%和74.33%；肝动脉组的穿透比率稍低；肝门静脉组肝癌/血浆的穿透比率为59.58%，远低于前2组，而外周静脉组的肝脏/血浆和肝癌/血浆穿透比率最小，分别为35.26%和16.08%(表2)。

表1 5-FU经不同途径给药后在大鼠肝脏、癌旁肝脏组织和血浆中的浓度分布Tab. 1 Distribution of 5-FU in rat hepatoma, liver tissue and plasma after different routes of administration

表2 5-FU经不同途径灌注后在大鼠肝脏中的穿透比率Tab. 2 The penetration rates of 5-FU in the rats livers through different routes of administration

3 讨 论

化疗药物杀灭或抑制癌变部位的肿瘤细胞，是通过在癌灶内达到和维持一定的药物浓度所产生的化学作用来实现的。要达到较好的化疗效果，应符合以下基本条件：①癌细胞要对化疗药物敏感；②药物在癌灶或靶组织器官中有较高浓度；③药物的不良反应小，尽可能经济实惠。目前，化疗是肝癌除手术以外一项重要的治疗措施，肝癌全身化疗效果不理想，有效率不超过20%。区域性灌注化疗是目前常采用的化疗方法，用于预防肝癌术后复发和不能切除的晚期肝癌的治疗［6-7］。

5-FU在现有化疗药物中是对肝癌疗效较好的药物，且不良反应小、价格便宜，是目前肝癌化疗最常用的药物［8］。本研究结果显示，经肝动脉、肝门静脉和结扎肝动脉后的肝门静脉3种途径区域性灌注化疗后，5-FU在癌旁肝脏组织和肝癌中的浓度分别为19.92～22.09 μg/g和8.86～16.42 μg/g，均显著高于经外周静脉注射全身化疗(9.45和4.31 μg/g)。相反，经外周静脉注射全身化疗时，5-FU的血浆药物浓度高达26.80 μg/mL，明显高于其它3个区域灌注化疗组的血药浓度(肝动脉组16.44 μg/mL，肝门静脉组14.87 μg/mL和结扎肝动脉后的肝门静脉组15.87 μg/mL)。从5-FU的穿透比率也可以看出，3组区域性灌注化疗的肝脏/血浆和肝癌/血浆的穿透比率分别为132.79%～139.19%和59.58%～103.47%，均远远大于外周静脉注射全身化疗。可见，区域灌注化疗可显著提高肝脏和肿瘤中的药物浓度、增加肝癌化疗效果，同时显著减少化疗药物在外周血中的暴露、降低药物的不良反应。

经肝动脉、肝门静脉和结扎肝动脉的肝门静脉3种不同途径对肝癌进行区域性灌注化疗，药物在肝脏和血浆中的分布差异不大，这与我们既往的研究结果一致［3］，但肝癌组织中的药物浓度存在较大的差异。经结扎肝动脉的肝门静脉和经肝动脉灌注化疗药物时，5-FU在癌灶中的浓度显著大于单纯经肝门静脉注射。原因可能是肝脏接受肝动脉和肝门静脉双重供血，肝脏从肝动脉血和肝门静脉血中摄取氧量约各占一半，故经肝动脉或肝门静脉灌注化疗药物时，5-FU在肝脏组织中的浓度差异不大；而肝癌的血液供应90%～95%来自肝动脉，肝门静脉供血只占很少的比例，因此，经肝动脉灌注时肝癌的药物浓度明显大于经肝门静脉灌注。结扎肝动脉后，肝门静脉血成为包括肝癌在内的整个肝脏的唯一血液供应来源，经肝门静脉灌注的化疗药物得以大量进入癌灶内。同时有研究表明［9-10］，肝癌的血管并不与肝动脉直接沟通，而是与瘤体的末梢肝门静脉和肝窦相通，药物是经这些吻合支进入肿瘤组织的，这也可能是结扎肝动脉后肝门静脉灌注5-FU在肝癌病灶中的浓度和穿透比率较单一的门静脉灌注时得以显著提高的缘故。

综上所述，区域性灌注化疗可通过有效提高肝癌和肝脏中的药物浓度而增加化疗效果，同时显著减少药物在外周血中的分布、降低毒副作用，其中经结扎肝动脉的肝门静脉灌注和经肝动脉灌注是肝癌区域性灌注化疗的2种较好途径。

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Distribution of 5-FU in rat hepatoma, liver tissue and plasma after locoregional infusion

ZHENG Jinglei1, LIANG Lijian2, WANG Zaiguo1, HUANG Wenjing3, WANG Xueding4(1. Department of Oncosurgery, Dongguan People’s Hospital, Dongguan Guangdong 523059, China; 2.Department of Hepatobiliary, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong 510080, China; 3. Guangdong Institute of Drug, Guangzhou Guangdong 510180, China; 4. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong 510080, China)

ZHENG Jinglei E-mail: jlzheng@126.com

Background and purpose:Locoregional infusion chemotherapy such as hepatic artery, or hepaticportal vein infusion is one of the most important treatments for hepatocelluar carcinoma. This study was aimed to investigate the distribution of fluorouracil(5-FU) in rat hepatoma, liver tissue and plasma after administrated by caudal vein or locoregional routes of hepatic artery, hepaticportal vein, and hepaticportal vein with ligated hepatic artery.Methods:Twenty-four tumor-bearing rats were divided into 4 groups randomly, and they were infused with 5-FU through peripheral vein(caudal vein), hepatic artery, hepaticportal vein or hepaticportal vein with ligated hepatic artery, which dose was 20 mg/kg. High performance liquid chromatography was adopted to measure the content of 5-FU in hepatoma, liver tissue and plasma, and the drug penetration rate among them were calculated.Results:The group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery reached the highest concentrations of 5-FU in live tissue andhepatoma, which concentrations were (22.1±9.5) μg/g and (16.4±7.2) μg/g. Then was the hepatic artery group, and the concentration of the hepaticportal vein group in the hepatoma focus was much smaller than the former 2 groups, which was (8.9±3.7) μg/g. The peripheral vein group got the lowest concentrations both in the liver tissue and hepatoma, which were (9.4±3.7) and (4.3±2.2) μg/g. The concentrations of 5-FU in the plasma in the peripheral vein group, the hepatic artery group, the group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery and the hepaticportal vein group were (26.8±12.5), (16.4±9.7), (15.9±10.1) and (14.9±8.5) μg/mL, which indicated that the drug concentrations of the latter 3 groups were much lower than the former group. The hepatoma/plasma penetration rate of 5-FU in the group of hepaticportal vein with ligated hepatic artery, the hepatic artery group, the hepaticportal vein group and the peripheral vein group were 103.47%, 92.94%, 59.58% and 16.08%.Conclusion:Compared to the peripheral venous bolus injection, locoregional infusion could significantly increase the concentrations of chemotherapy agent in hepatoma focus and liver tissue, and decrease the drug distributions in peripheral blood. And the infusion through hepaticportal vein with ligated hepatic artery and through hepatic artery reaches higher concentrations in the hepatoma focuses, which indicate that they are 2 practical and promising routes for the locoregional chemotherapy of hepatoma.

Fluorouracil; Hepatoma; Regional chemotherapy; Penetration rate

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.008

R735.7；R73-36

A

1007-3639(2015)01-0045-05

2014-03-16

2014-12-03）

广东省科技计划项目(2011B020800001)、广东省医学科研基金(B2010324)、东莞市科技计划项目(2010105150009)。

郑惊雷 E-mail:jlzheng@126.com