冬凌草甲素对胰腺癌细胞骨架蛋白F-actin的影响

南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京，210046

冬凌草甲素对胰腺癌细胞骨架蛋白F-actin的影响

刘军楼，沈洪，徐力，杨继兵，于希忠，孙志岭

南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京，210046

背景与目的：中医药治疗肿瘤不良反应低且疗效显著，在防治胰腺癌方面有较大的潜力与优势，日益受到国内、外医学界的关注。本研究观察中草药冬凌草的有效成分冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990凋亡及细胞骨架蛋白F-actin的影响。方法：以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的SW1990细胞，采用MTT法检测细胞生长抑制率，DAPI染色法染色后荧光显微镜观察细胞核凋亡、流式细胞仪检测细胞凋亡率，激光共聚焦显微镜观察F-actin形态学变化。结果：冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞具有明显的增殖抑制作用，荧光显微镜见到典型的凋亡形态学改变。流式细胞仪检测结果显示，25、50 μmol/L冬凌草甲素给药组早期凋亡的百分率显著高于对照组(3.78±0.46，9.51±0.63 vs 0.73±0.06，P<0.05)，晚期凋亡和坏死细胞的百分率也显著高于未给药组(14.40±1.78，20.53±2.54 vs 4.16±0.31，P<0.05)。细胞骨架蛋白F-actin呈现解聚状态。结论：冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能是药物引起了细胞骨架蛋白F-actin解聚。

冬凌草甲素；胰腺癌；增殖抑制；凋亡；细胞骨架蛋白

中草药冬凌草系唇形科香茶菜属植物，学名碎米亚，味苦甘、性微寒，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤等作用。冬凌草主要化学成分为贝壳杉烯类的二菇，其中最重要的抗癌有效成分确定为冬凌草甲素(oridonin)。最新研究结果表明，冬凌草甲素对胃癌SGC-7901细胞、人白血病细胞、人肝癌HepG2细胞、骨肉瘤细胞、胆囊癌细胞和A549肺癌细胞等有治疗作用［1-6］。有研究提示冬凌草甲素对人胰腺癌细胞有生长抑制作用［7-8］。关于冬凌草甲素作用于细胞骨架蛋白肌动蛋白(actin)的研究，尚未见文献报道。我们前期研究发现冬凌草甲素对胰腺癌细胞有抑制作用，其作用机制可能是药物引起了端粒酶hTERT mRNA表达下降，并影响了细胞质中细胞骨架蛋白β-actin的形态［9-10］。本研究在前期基础上进一步作冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞骨架蛋白F-actin影响的研究，探究其可能机制，为其应用于临床提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 药物和细胞株

冬凌草甲素购自南京泽朗医药科技有限公司(纯度≥98%)；人胰腺癌SW1990细胞株为上海长海医院消化内科实验中心惠赠。SW1990细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于25 mL塑料培养瓶中，37 ℃，CO2体积分数为5%的培养箱常规培养。冬凌草甲素用1 mL DMSO溶解后加入三蒸水9 mL，配制成含10% DMSO浓度为100 mmol/L的母液，-4 ℃保存，应用时加培养基稀释成目标浓度(DMSO的终浓度≤0.01%，无明显细胞毒作用)。

1.2 试剂

胰蛋白酶、DMEM培养基(美国Gibco公司)、MTT、DMSO(美国Sigma公司)、DAPI试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)、小牛血清(美国PAA公司)、CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent(美国Abcam公司)。

1.3 主要仪器设备

MCO-20A IC二氧化碳培养箱(SANYO)，超净工作台，荧光显微镜，MDF-382超低温冰箱(日本SANYO公司)，IX50型倒置显微镜(日本Olympus公司)，Biophometer分光光度计，5417型低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，FACScan型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)等。

1.4 方法

1.4.1 细胞生长抑制率的测定

采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测。取对数生长期的SW1990细胞，调整细胞浓度为1× 105/mL，将细胞悬液接种于无菌96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养12 h细胞完全贴壁后弃上清液分别加入含3.125、6.25、12.5、25、50及100 μmol/L冬凌草甲素案的DMEM培养基100 μL，每种浓度均设6个平行孔；对照组加入不含药物的0.05% DMSO的培养液100 μL。将培养板置于37 ℃、饱和湿度、CO2体积分数为5%的温箱中常规培养12、24、36和48 h后，于终止培养前4 h，各孔均加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续培养4 h后弃上清液，各孔加入DMSO 150 μL，震荡器上振荡5～10 min溶解蓝色结晶，待孔内结晶完全溶解并色素均匀后，以酶标仪于490 nm处读取各孔吸光度(A490)值，计算细胞生长抑制率与IC50。细胞生长抑制率(%)=［A对照组-A实验组］/A对照组×100%。实验重复3次。

1.4.2 DAPI染色后荧光显微镜观察细胞的形态学变化

采用DAPI染色法观察细胞核凋亡变化。具体操作步骤为 ①细胞爬片：消毒灭菌的盖玻片放置于6孔板内，取对数生长期的SW1990细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，将细胞悬液接种于无菌6孔细胞培养板中，每孔2 mL，培养12 h细胞完全贴壁后弃上清液分别加入含25及50 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培养基2 mL；对照组加入不含药物的0.05% DMSO的培养液2 mL。将培养板置于37 ℃、饱和湿度、CO2体积分数为5%的温箱中常规培养至24 h后弃上清液；②固定：PBS漂洗3次，培养细胞爬片在4 ℃预冷的4%多聚甲醛中固定30 min后，常温下PBS漂洗3次，每次5 min；③DAPI染色：加入DAPI染色稀释液，室温染色3～5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；④从培养板中取出盖玻片，立即倒置于玻片上方，荧光封片剂封片，室温放置1～2 h待封片剂凝固，于荧光显微镜上观察并摄影。

1.4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

用Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒。细胞接种方法和浓度同1.4.2，培养24 h后弃上清液。PBS洗涤贴壁细胞1次，用胰酶细胞消化液(含有EDTA)消化细胞，加入2 mL的DMEM培养基，吹打细胞后转移到离心管内，1 000×g离心5 min，弃上清液，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5～10万重悬的细胞，1 000×g离心5 min，弃上清液，加入195 μL AnnexinⅤ-FITC结合液轻轻重悬细胞，后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，轻轻混匀。室温(20～25 ℃)避光温育10 min。1 000×g离心5 min，弃上清液，加入190 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。

1.4.4 采用F-actin抗体免疫荧光染色法观察细胞质细胞骨架蛋白变化

具体操作步骤为 ①细胞爬片：洁净的盖玻片消毒灭菌后放置于6孔板内，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×105/mL接种于6孔板中，每孔2 mL，培养12 h细胞完全贴壁后弃上清液分别加入含25及50 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培养基2 mL，培养24 h后弃上清液；②固定：用PBS分3次取代6孔板中的培液后，去除PBS，培养细胞爬片在4 ℃预冷的4%多聚甲醛中固定30 min，常温下PBS漂洗3次，每次5 min；③封闭：加入免疫染色封闭液，培养板放入湿盒，4 ℃冰箱封闭60 min；④CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent剂盒中F-actin一抗温育：按照1∶100比例用免疫染色一抗稀释液稀释F-actin抗体，吸净封闭液，立即加入稀释好的一抗，4 ℃冰箱温育过夜后，常温下PBS漂洗3次，每次5 min；⑤二抗温育：按照1∶100比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释的二抗，吸净PBS液，立即加入稀释好的二抗，4 ℃冰箱中温育1 h后，常温下PBS漂洗3次，每次5 min；⑥从培养板中取出盖玻片，立即倒置于载玻片上方，荧光封片剂封片，室温放置1～2 h待封片剂凝固后，于激光共聚焦显微镜上观察并摄影。

1.5 统计学处理

采用 SPSS 18.0统计软件进行统计分析，实验数据以±s 表示，计量资料用方差分析比较组间差异性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 冬凌草甲素对SW1990细胞的生长抑制作用

冬凌草甲素浓度为3.125、6.25 μmol/L时对细胞的生长无明显的抑制作用，冬凌草甲素浓度为12.5、25、50和100 μmol/L处理细胞后抑制率随给药浓度增加和作用时间延长而逐渐增加，呈明显的时间和剂量依赖关系。其中12.5、25和50 μmol/L的药物作用24 h的抑制率分别为38.9%、45.9%及62.1%，24 h冬凌草甲素作用的IC50值为35.43 μmol/L［9］。

2.2 冬凌草甲素对SW1990细胞凋亡形态的影响

DAPI染色后，荧光显微镜观察细胞核凋亡。对照组细胞核较大，核大小及染色均匀，染色较浅(图1A)。冬凌草甲素给药组细胞数量减少，部分细胞核体积变小，细胞出现典型的凋亡改变(见图中白色箭头)，凋亡细胞主要表现荧光染色增强、细胞核浓缩及细胞核碎裂等典型改变(图1B、C)。

2.3 冬凌草甲素对SW1990细胞凋亡率的影响

流式细胞仪分析结果显示，冬凌草甲素均可诱导细胞凋亡发生。冬凌草甲素不同浓度组早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞、死亡细胞总数的百分率，与对照组相比，显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，表1、图2)。

图1 DAPI荧光染色后观察细胞核凋亡Fig. 1 Morphology of cell apoptosis was observed by DAPI stain after oridonin treatment (×200)

表1 流式细胞仪检测冬凌草甲素对SW1990细胞凋亡的影响Tab. 1 Cell apoptotic rate was detected by flow cytometry after treated with different concentrations of oridonin

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡结果Fig. 2 Apoptotic rate of SW1990 cells treated with different concentrations of oridonin was detected by flow cytometry

2.4 冬凌草甲素对SW1990细胞骨架蛋白F-actin的影响

对细胞爬片进行扫描，摄影形成F-actin抗体免疫荧光染色细胞质图。同等培养条件下，鬼笔环肽(phalloidin)能和细胞的纤维肌动蛋白F-actin特异性的结合，由FITC-phalloidin标记的细胞F-actin呈橘红色荧光，主要分布在细胞膜和细胞质内。激光共聚集显微镜观察细胞的形态学变化。结果显示，阴性对照组细胞平铺在培养皿底部，伸展良好，有大量的伪足出现；细胞的形状不规则，细胞中F-actin较为浓密，排列规则。在细胞的周边和突出的部位F-actin相对富集(图3A)。经过冬凌草甲素药物处理后的细胞，细胞的F-actin纤维在胞质中明显减少，且排列比较紊乱，在细胞膜的周边，出现了F-actin纤维的堆积，边缘呈破损状。与对照组相比差别明显，细胞中央区F-actin稀疏，免疫荧光减弱，排列紊乱，且处理后的细胞伪足结构少，细胞呈现蜷缩的状态，冬凌草甲素浓度越高细胞数目减少越明显，蜷缩越明显(图3B、3C)。

图3 F-actin抗体免疫荧光染色Fig. 3 The morphological changes of F-actin by immunofluorescence staining were observed by laser confocal microscopy

3 讨 论

胰腺癌是恶性程度较高的人类肿瘤之一，其临床症状隐匿，早期诊断十分困难，80%～85%的胰腺癌患者确诊时已至中晚期。中晚期胰腺癌西医治疗疗效欠佳，而中医药治疗肿瘤毒副作用低且疗效显著，在防治胰腺癌方面有较大的潜力与优势，日益受到国内、外医学界的关注［11-15］。本研究探讨了中药单体冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞的生长抑制作用，并分析了其可能作用机制，为该药的临床抗胰腺癌应用提供理论基础。

本研究选择SW1900细胞株，应用多种方法观察冬凌草甲素对肿瘤细胞的影响。结果显示，冬凌草甲素处理细胞后抑制胰腺癌细胞生长，与文献报道［7，16］一致。本研究DAPI染色后荧光显微镜观察细胞核凋亡发现，冬凌草甲素给药组细胞出现典型的凋亡改变。流式细胞仪检测结果显示不同浓度组早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞、死亡细胞总数的百分率，均高于对照组，说明冬凌草甲素可诱导细胞凋亡发生，其抑制肿瘤细胞增殖作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

细胞骨架是细胞内蛋白质成分组成的网络结构，包括微管、微丝和中间纤维。微丝是3种骨架结构中最细的，主要由actin组成，以游离球状actin(G-actin)或F-actin形式存在。Rao等［17］研究表明actin聚合/解聚状态的改变，即actin骨架重组，对恶性肿瘤细胞的形态和表型有非常重要的调节作用，认为干预细胞骨架微丝actin重组可作为抗癌药物的作用靶点，也可作为研发新的抗肿瘤药物的依据。本研究通过F-actin抗体免疫荧光染色法观察冬凌草甲素对肿瘤细胞骨架蛋白影响，研究结果提示，药物干预后引起了F-actin聚合/解聚状态的改变，主要可能是药物引起了F-actin解聚，导致F-actin相对减少而G-actin相对增加，从而呈现细胞质荧光染色减弱。

关于冬凌草甲素诱导细胞凋亡机制，魏凤香等［16］认为抗凋亡蛋白Bcl-2表达的降低和促凋亡蛋白Bax上调是其诱导胰腺癌SW1900细胞发生凋亡的重要作用机制，宋芳等［7］认为冬凌草甲素通过下调survivin的表达和上调p21的表达来诱导细胞发生凋亡和周期阻滞。actin是构成细胞骨架的主要成分，其表达水平的变化与细胞形态变化密切相关，研究已明确显示细胞骨架的动态变化能调控细胞凋亡［18-19］。细胞凋亡时actin细丝发生断裂，actin网络结构遭到破坏，这是细胞凋亡时形态改变的一个典型特征，那么，通过改变这一典型特征是否就能导致细胞凋亡呢？对此，White等［20］作了深入的研究。他们用细胞松弛剂D抑制气管1HAEo细胞和主支气管上皮细胞actin的延伸，或通过Jaspakinolide促进actin的聚集，发现改变actin的整体性会导致细胞在5 h内出现典型的凋亡形态学改变。该研究提示actin可能是细胞凋亡早期的调控物之一。进一步研究表明，通过改变actin稳定状态，可以导致凋亡的发生［21-22］。F-actin的解聚是凋亡过程中所必须的，其解聚出现在凋亡小体形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，当Caspases攻击actin时，可将其切断降解为15×103和31×103两个片段，使之不能重新聚合，并由于15×103片段的形成而引起细胞凋亡形态的改变［23］。本研究发现冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，同时药物干预后引起了actin状态的变化，即细胞骨架蛋白F-actin解聚，分析其作用机制可能是药物引起了F-actin解聚从而导致了凋亡的发生。至于F-actin解聚是否由于Caspases蛋白水解酶作用尚有待进一步研究。

有研究显示actin重组与Rho家族蛋白密切相关，Rho家族蛋白最主要的功能是调节actin重组，从而调节细胞的形态变化和运动。它归属Ras超家族，为一类小分子G蛋白(small G protein，又称GTPase)。Rho家族蛋白3个亚家族Rho、Rac和CDC42通过Rho/ROCK、Rac/PAK和CDC42/PAK通路来调节actin聚合/解聚状态引起细胞骨架重组［24-27］。冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能是药物干预后引起了F-actin解聚。至于药物引起F-actin解聚的机制是否与Rho家族蛋白密切相关，尚有待进一步研究证实。

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Effects of oridonin on cytoskeletal protein F-actin in human pancreatic carcinoma cells

LIU Junlou, SHEN Hong, XU Li, YANG Jibing, YU Xizhong, SU Zhiling (The First Clinical Medicine College of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210046, China)

SHEN Hong E-mail: shenhong999@163.com

Background and purpose:Traditional Chinese medicine with notable effect and little adverse reaction is increasingly concerned about the medical profession because of its great potential and advantage in treating pancreatic carcinoma. In this experiment, we studied the effects of oridonin on apoptosis and cytoskeletal protein F-actin in human pancreatic carcinoma SW1990 cells.Methods:SW1990 cells in culture medium were treated with different concentrations of oridonin. The inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. Morphology of cell apoptosis was observed by DAPI stain and cell apoptotic rate was detected by flow cytometry (FCM). The morphological changes of F-actin were observed by laser confocal microscopy.Results:The growth of human pancreatic carcinoma SW1990 cells was significantly inhibited by oridonin. Apoptosis morphological changes including condensation of chromatin and nuclear fragmentation were observed clearly by DAPI stain. The early apoptotic rate of SW1990 cells treated with 25, 50 μmol/L oridonin was significantly higher than that of the control group (3.78±0.46, 9.51±0.63 vs 0.73±0.06, P<0.05), and the late apoptotic rate and cell necrosis rate were also significantly higher than that of the control group (14.40±1.78, 20.53±2.54 vs 4.16±0.31, P<0.05). F-actin was showed from polymerization to depolymerization after oridonin treatment.Conclusion:Oridonin can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of SW1990 cells. The mechanisms may involve the depolymerization of F-actin after treatment with oridonin.

Oridonin; Pancreatic carcinoma; Antiproliferation; Apoptosis; Cytoskeletal protein

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.006

R735.9；R73-36

A

1007-3639(2015)01-0031-07

2014-09-22

2014-12-04）

江苏省中医药局课题资助项目(LZ11196)；江苏省高校自然科学基金资助项目(13KJB360011)。

沈洪 E-mail:shenhong999@163.com