Δ133p53异构体在5-FU抑制胃癌MKN45细胞系生长实验中的作用

郭爱，季万胜，姜琪琪，李萌萌，杨炳乾，高志星

1.潍坊医学院研究生部，山东 潍坊 261000；

2.潍坊医学院附属医院消化内科，山东 潍坊 261000

Δ133p53异构体在5-FU抑制胃癌MKN45细胞系生长实验中的作用

郭爱1，季万胜2，姜琪琪1，李萌萌1，杨炳乾1，高志星2

1.潍坊医学院研究生部，山东 潍坊 261000；

2.潍坊医学院附属医院消化内科，山东 潍坊 261000

背景与目的：Δ133p53具有促进肿瘤细胞生长的作用，但具体作用机制尚不明确，本实验是采用5-FU-MKN45胃癌细胞系模型，观察p53异构体Δ133p53表达与p53基因下游MDM2、cyclin G1基因表达的相关性。方法：使用不同浓度5-FU(50 μg/mL，100 μg/mL)作用于人胃癌MKN45细胞系后，MTT法检测细胞抑制率，巢式逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR法)检测Δ133p53、MDM2及cyclin G1 mRNA的表达变化。组间差异用单因素方差分析，组内比较用t检验，两变量相关性用Pearson直线相关分析。结果：MTT结果显示，随着5-FU浓度增高以及作用时间的延长，细胞抑制率逐渐增加，4组实验中50 μg/mL 5-FU作用于MKN45细胞24、48和78 h后抑制率平均值分别为41.10%、54.79%和68.48%，差异有统计学意义(F=45.52，P=0.00)。100 μg/mL 5-FU作用于MKN45细胞24、48和78 h后抑制率平均值分别为69.53%、78.21%和86.92%，差异有统计学意义(F=85.58，P=0.00)。50和100 μg/mL 5-FU作用于MKN45细胞24 h后抑制率分别为41.10%和69.53%，差异有统计学意义(F=51.29，P=0.00)。50和100 μg/mL 5-FU作用于MKN45细胞48 h后抑制率分别为54.79%和78.21%，差异有统计学意义(F=51.29，P=0.00)。50和100 μg/mL 5-FU作用于MKN45细胞72 h后抑制率分别为68.48%和86.82%，差异有统计学意义(F=104.91，P=0.00)。RT-PCR结果显示，随着5-FU浓度的增加，胃癌细胞系MKN45细胞中Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA和cyclin G1 mRNA表达量逐渐下降，组间差异具有统计学意义(F值分别为738.532、1 396.607和2 785.560，P=0.00)。相关性分析显示，Δ133p53 mRNA与MDM2 mRNA在胃癌中表达呈正相关(r=0.871，P=0.01)，而cyclin G1 mRNA的表达与Δ133p53 mRNA没有明显的相关性(P=0.13)。结论：在5-FU-MKN45模型中，Δ133p53参与的5-FU的抗肿瘤途径与MDM2有关，与cyclin G1无关。

5-FU；胃癌；Δ133p53；MDM2；cyclin G1

胃癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。作为最早发现的抑癌基因，p53基因与胃癌的关系远未阐明。部分胃癌检出该基因突变，但其生物学意义仍不清楚［1-2］。最近发现的p53蛋白异构体为深入了解p53与胃癌之间的相互关系、胃癌分子诊断乃至生物学治疗开启了一扇新的窗口。本研究采用RT-PCR技术，以5-FU干预表达野生型p53基因的胃癌MKN45细胞系为研究模型，分析Δ133p53及p53基因下游分子MDM2、cyclin G1在胃癌细胞生长抑制过程中的表达变化，旨在探讨Δ133p53的功能及其生物学意义。

1 材料和方法

1.1 主要材料及试剂

人胃癌MKN45细胞株，为第四军医大学馈赠，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品，RPMI-1640培养基及胰蛋白酶为济南凯晨生物科技有限公司产品。5-FU为上海旭东海普药业有限公司产品(国药准字H31020593)，TRIzol试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品，M-MULV第一链cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR引物为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.2 胃癌细胞培养

MNK45细胞培养于RPMI-1640培养基(内含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素)中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中，使用0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养，每2天更换培养液，在显微镜下观察细胞的生长状况，待细胞贴壁生长3 d后传代，取对数生长期细胞用于此次实验。

1.3 不同浓度5-FU对MKN45细胞增殖抑制率的MTT检测

取对数生长期细胞，按照每孔4×104～5×104/mL的密度接种于96孔板，体积为200 μL/孔。培养24 h，待细胞贴壁后加入5-FU，设置实验组及空白对照组，空白对照组不加细胞，实验组分别加浓度为0、50和100 μg/mL的5-FU。每组设5个复孔，边缘孔中加入无菌PBS。在37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中分别培养24、48和72 h后，将5 mg/mL的MTT溶液20 μL依次加入孔中，培养4 h后，将上清液弃掉，再每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，充分溶解结晶，测定每吸孔光度(A)值，取5孔的平均值，计算细胞生长抑制率。

1.4 不同浓度5-FU影响下△133p53 mRNA、MDM2 mRNA及cyclin G1 mRNA表达的PCR检测

取对数生长期的MKN45细胞，平均放置在3个培养瓶中，分别加入0、50和100 μg/mL浓度的5-FU并做好标记，培养2 d后收集细胞，按TRIzol试剂盒说明书操作来提取细胞总RNA，使用紫外分光光度仪测纯度和浓度。再按照逆转录试剂盒说明书操作，进行逆转录合成cDNA，以β-肌动蛋白(β-actin)作内参照，进行RT-PCR扩增。PCR仪中反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55～58 ℃退火30 s； 72 ℃延伸30 s；扩增35个循环，循环结束后72 ℃总延伸7 min，于4 ℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，恒压100 V电泳20 min，用凝胶成像分析系统观察结果并拍照。引物序列见表1。

表1 引物序列表Tab. 1 Primer sequence table

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各组实验数据均用±s 表示，各组间差异采用单因素方差分析，进一步组内比较采用t检验，两变量间采用Pearson直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-FU对人MKN45胃癌细胞系增殖的影响

由表2可见，将不同浓度5-FU作用于MKN45胃癌细胞系24、48、72 h后，可以看出胃癌细胞抑制率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。且随着药物浓度的升高和作用时间的延长，细胞抑制率呈现明显的上升趋势，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同浓度5-FU对Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA、cyclin G1 mRNA表达的影响

由表3、图1可见，将不同浓度的5-FU作用于MKN45胃癌细胞系后，Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA和cyclin G1 mRNA的表达量均低于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。并且随着药物浓度的升高，Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA和cyclin G1 mRNA的表达量逐渐降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表2 不同浓度的5-FU在不同时间对MKN45胃癌细胞增殖的抑制情况Tab. 2 The inhibition of 5-FU with different concentrations and different time on MKN45 gastric cancer cell proliferation

表3 △133p53 mRNA、MDM2 mRNA、cyclin G1 mRNA的相对表达量Tab. 3 The relative expression of △133p53 mRNA, MDM2 mRNA and cyclin G1 mRNA

图1 MKN45细胞经不同5-FU浓度作用后Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA及cyclin G1 mRNA的表达情况Fig. 1 The expression of Δ133p53 mRNA, MDM2 mRNA and cyclin G1 mRNA under different concentrations of 5-FU and different time on MKN45 gastric cancer cell

2.3 Δ133p53 mRNA与MDM2 mRNA、cyclin G1 mRNA表达相关性分析

随着5-FU浓度的增加，Δ133p53 mRNA、MDM2 mRNA和cyclin G1 mRNA的相对表达量均呈降低趋势，Pearson直线相关分析结果显示 Δ133p53 mRNA表达与MDM2 mRNA表达呈正相关(r=0.98，P<0.05，图2)，而Δ133p53 mRNA的表达量与cyclin G1 mRNA无明显相关性(P=0.13)。

图2 Δ133p53 mRNA表达与MDM2 mRNA表达的相关性Fig. 2 The correlation between the expression of Δ133p53 mRNA and MDM2 mRNA

3 讨 论

早前研究发现胃癌中存在p53基因突变，p53基因的失活，可能是因为碱基缺失而发生突变，也可能是因为p53蛋白的调节途径被破坏导致。p53基因发挥其生物学功能的确切机制目前还不清楚，其肿瘤抑制功能可能是和特定基因以p53应激元件的形式形成四聚体来调节基因的表达［3］。p53基因至少可以转录出9种异构体，分别为Δ133p53γ、Δ40p53、Δ40p53γ、p53、p53γ、p53β、Δ133p53、Δ40p53β、Δ133p53β［4-5］，在这几种异构体中，Δ133p53、Δ40p53异构体具有促肿瘤生长的作用［6-7］，p53β、p53γ具有抑制肿瘤生长的作用［8-9］。之前的研究已证明p53β异构体参与p53的途径是肿瘤生长抑制的重要途径之一［10］。而△133p53异构体作用机制尚未完全阐明。

5-FU是传统的化疗药之一，主要是通过使细胞增殖过程停滞在S期导致细胞死亡，对消化道肿瘤、乳腺癌及滋养细胞肿瘤等多种恶性肿瘤均有治疗效果［11］。本研究结果显示，随着5-FU浓度增加，Δ133p53 mRNA的表达量逐渐减少，且Δ133p53 mRNA的表达量的减少与细胞抑制率一致，推测胃癌细胞经过5-FU治疗后，可使得胃癌细胞中Δ133p53表达量减少，其抗肿瘤作用可能是通过Δ133p53 mRNA的表达量的减少来实现的。MDM2基因是p53蛋白重要的1个靶基因，在肿瘤的治疗及预后等方面发挥了重要作用。MDM2可以结合p53蛋白的氨基末端引起p53基因的失活、出核转运、降解［12］，MDM2表达增多会使得p53途径的肿瘤抑制功能减弱。Baccouche等［13］报道，在许多具有p53基因突变的肿瘤中MDM2呈过度表达。本研究结果显示，在5-FU作用下，MDM2表达量渐减少，说明5-FU可以控制MDM2途径来实现抗肿瘤作用，Δ133p53与MDM2表达呈正相关，因此，Δ133p53可以影响5-FU作用下的MDM2的抗肿瘤途径，但由于Δ133p53异构体缺少氨基末端，缺少MDM2结合位点，所以并不能够独立对MDM2这一途径进行调节。Δ133p53可以通过调节p53基因的功能来诱导细胞凋亡和细胞周期停滞［2］。Marcel等［14］的研究表明Δ133p53是一种新型的p53基因靶，可能参与一个负反馈通路调节p53的抑癌作用。因此，推测Δ133p53参与的5-FU抑癌作用是通过与p53形成蛋白四聚体复合物作用于p53-MDM2途径来调节胃癌细胞的增殖活性，引起细胞凋亡。cyclin G1是最近几年新发现的一种细胞周期蛋白。Perez等［15］及Chen等［16］的研究发现，cyclin G1在很多种肿瘤细胞中均高表达，如成骨肉瘤细胞、结肠癌细胞、伯基特淋巴瘤细胞及人宫颈癌细胞等肿瘤细胞。本研究结果显示，在5-FU作用下cyclin G1的表达量降低，表明5-FU同样可以干扰cyclin G1途径来抑制癌细胞生长，但cyclin G1 mRNA与Δ133p53 mRNA表达量无相关性，推测Δ133p53并不可以通过介导cyclin G1途径来发挥抑制肿瘤生长的作用。

本研究结果显示，Δ133p53异构体可以与p53协同作用于p53-MDM2途径，来加强5-FU的抗肿瘤作用，说明Δ133p53异构体可作为进一步研究胃癌的重要突破口。而cyclin G1的作用方式还未研究清楚，Δ133p53与cyclin G1的关系还有待进一步研究。

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The role of Δ133p53 during 5-FU inhibition experiments on the growth of gastric cancer cell line MKN45

GUO Ai1, JI Wansheng2, JIANG Qiqi1, LI Mengmeng1, YANG Bingqian1, GAO Zhixing2

(1.Department of Graduate, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261000, China; 2. Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang Shandong 261000, China)

GAO Zhixing E-mail: gzx8229@sina.com

Background and purpose:Δ133p53 can promote tumor cell growth, but the exact mechanism is not clear. This study was aimed to observe the expression and significant of the p53 isoforms Δ133p53 and p53 gene downstream molecules MDM2 and cyclin G1 genes by 5-FU-MKN45 gastric cancer cell line model.Methods:After using different concentrations of 5-FU (50 μg/mL, 100 μg/mL) to human gastric cancer cell line MKN45, inhibition rate should be detected by MTT assay, the changes of Δ133p53 mRNA, MDM2 mRNA and cyclin G1 mRNA expressing were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Differences between these groups were analyzed by ANOVA, comparisons within groups were analyzed by t-test, bivariate correlation was analyzed by Pearson linear correlation.Results:MTT results showed that with the increased concentration of 5-FU and the extension of time, the cell inhibition rates increased gradually. The inhibition rates of 50 μg/mL 5-FU were 41.10%, 54.79% and68.48%, for culturing 24, 48 and 72 hours. There were statistically significant differences between the groups(F=45.52, P=0.00). The inhibition rates of 100 μg/mL 5-FU were 69.53%, 78.21% and 86.92%, for culturing 24, 48 and 72 hours. There were statistically significant differences between the groups(F=85.58，P=0.00). The inhibition rates of 50 and 100 μg/mL were 41.10% and 69.53%, for culturing 24 hours. There were statistically significant differences between the groups(F=51.29, P=0.00). The inhibition rates of 50 and 100 μg/mL were 54.79% and 78.21%, for culturing 48 hours. There were statistically significant differences between the groups(F=51.29, P=0.00). The inhibition rates of 50 and 100 μg/mL were 68.48% and 86.82%, for culturing 72 hours. There were statistically significant differences between the groups(104.91, P=0.00). RT-PCR results showed that with the increase of the concentration of 5-FU, the Δ133p53 mRNA, MDM2 mRNA and cyclin G1 mRNA expression gradually declined in gastric cancer cell line MKN45 cells, and there were statistically significant differences between the groups(F=738.532, 1 396.607, 2 785.56，P=0.00). Correlation analysis showed that the expressions of Δ133p53 mRNA and MDM2 mRNA in gastric cancer were positively correlated (r=0.871, P=0.01), while the expression of cyclin G1 mRNA and p53 mRNA had no obvious relevance (P=0.13).Conclusion:In the 5-FU-MKN45 gastric cancer cell line model, anti-tumor pathway of Δ133p53 isomers is related with MDM2 but was not related with cyclin G1.

5-FU; Gastric cancer; Δ133p53; MDM2; Cyclin G1

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.005

R735.2

A

1007-3639(2015)01-0025-06

2014-07-08

2014-11-07）

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2010SW034)。

高志星 E-mail:gzx8229@sina.com