宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

陈蔚，杨慧娟，徐军，朱昊平

1.复旦大学附属肿瘤医院妇瘤科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学附属闵行医院妇产科，上海 201199；

3.上海市计划生育科学研究所，上海 200032

宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

陈蔚1，杨慧娟1，徐军2，朱昊平3

1.复旦大学附属肿瘤医院妇瘤科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学附属闵行医院妇产科，上海 201199；

3.上海市计划生育科学研究所，上海 200032

背景与目的：DNA甲基化是宫颈上皮癌变过程中常见的表观遗传改变。本研究旨在检测同源盒转录因子1ɑ(LMX1A)基因和配对盒基因家族PAX1基因在浸润性宫颈鳞癌(invasive cervical cancers，ICC)组织中的甲基化水平，评估其作为分子标志物用于区分各级别宫颈病变的潜在临床价值。方法：在32例低级别宫颈上皮内瘤变(low-grade cervical intraepithelial neoplasia，LG-CIN)、34例高级别宫颈上皮内瘤变(high-grade cervical intraepithelial neoplasia，HG-CIN)、27例ICC病变宫颈组织和28例慢性宫颈炎为正常对照组(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NLM)中，采用巢式PCR和焦硫酸测序(pyrosequencing)技术定量分析LMX1A基因的6个位点和PAX1基因的9个位点的甲基化。并通过受试者工作特征曲线下面积(receiver operating characteristic curve，ROC)的计算获得上述基因的甲基化检测用于诊断各级别宫颈病变的准确性。结果：宫颈癌中的LMX1A基因6个位点的甲基化平均水平为14.36%，明显高于HG-CIN病变的4.70%、LG-CIN病变的5.05%和NLM的4.53% (P<0.01)。宫颈癌中PAX1基因9个位点的甲基化平均水平为41.97%，明显高于HG-CIN的10.21%(P<0.01)；而后者又明显高于LG-CIN的5.55%和NLM的4.92%(P<0.01)。检测LMX1A基因甲基化和PAX1基因甲基化水平鉴别宫颈癌的ROC曲线下面积分别为0.603(P=0.104)和0.883(P<0.001)。经ROC曲线下面积计算获得最佳PAX1基因甲基化水平的界定值为20.50%，其诊断浸润性宫颈癌的灵敏度为81%、特异度为93%。当PAX1基因甲基化水平界定值为9.58%时，其检测浸润性宫颈癌的灵敏度为89%、特异度为84%。结论：定量分析宫颈组织中的PAX1基因甲基化将有可能作为分子标志物用于浸润癌的鉴别诊断，而LMX1A基因的甲基化检测临床价值有限。

宫颈癌；宫颈上皮内瘤变；DNA甲基化；LMX1A基因；PAX1基因

最近的全球流行病学资料表明，宫颈癌的发病率和死亡率分别居于女性恶性肿瘤的第3位和第4位［1］。在我国，最新的一项全国流行病学研究提示，如果缺少有效的干预手段，全国各地每年宫颈癌的新发病率将由2010年的27 000～130 000上升至2050年的42 000～187 000［2］。

高危型人类乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV) (HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56及58等)的持续性感染是宫颈癌的病因［3-4］。但宫颈上皮的癌变过程还包括许多基因和表观基因的改变。DNA甲基化是最常见的表观遗传改变，常发生于肿瘤抑制基因的启动子区域，造成该基因的转录失活，从而促使肿瘤的发生。综合文献报道［5］，70%～100%的宫颈癌中可检测到DNA甲基化，且可见于30%～80%的宫颈癌前期病变中。已有研究表明，检测宫颈脱落细胞中特定基因的甲基化可能作为潜在的分子标志物用于宫颈癌的早期检测。我们以往采用甲基化特异PCR(methylation specific PCR，MSP)的方法发现CDH1、p16、SOX1、RASSFA1基因在宫颈癌前期病变和浸润性宫颈癌中的甲基化状态存在差异［6-10］。

LIM同源盒转录因子1ɑ(LMX1A)基因是LIM同源盒基因家族的一员，该基因家族编码LIM同源盒位点蛋白(LIM-homeodomain，LIM-HD)，在人类胚胎干细胞分化为中脑多巴胺神经元的过程中起重要作用［11］。近年来，越来越多的研究发现其表达失活和肿瘤的发生、发展有关［12］。在宫颈癌中，该基因的失活已被证实和基因甲基化有关［13］。PAX1基因是配对盒基因转录因子家族成员(paired box，PAX)参与生骨节的分化，和同源盒基因协同作用在哺乳动物脊柱和胚胎以及细胞增殖控制过程中发挥重要作用［14］。Lai等［13］研究发现，该基因在宫颈癌中因启动子甲基化而表达失活，经去甲基化处理后基因重新表达。PAX1基因甲基化常可见于宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ级及浸润性宫颈癌患者的宫颈脱落细胞中［15］。

本研究联合巢式PCR技术和焦磷酸测序技术定量(pyrosequencing)分析正常宫颈、宫颈低级别病变，宫颈高级别病变以及宫颈鳞癌组织中PAX1和LMX1A基因的甲基化水平，以期探讨PAX1和LMX1A基因的甲基化水平检测在区分各级别宫颈病变中的潜在临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2011年1月—2013年4月在复旦大学附属闵行医院因宫颈脱落细胞异常在宫颈专科接受阴道镜下宫颈活检的患者共121例，经组织病理证实为宫颈低级别上皮内瘤变(low-grade cervical intraepithelial neoplasia，LG-CIN)患者共32例、高级别上皮内瘤变(high-grade cervical intraepithelial neoplasia，HG-CIN)患者共34例、浸润性宫颈鳞癌(invasive cervical cancers，ICC)患者共27例，另有28例慢性宫颈炎患者作为正常对照(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NLM)。所有患者平均年龄39岁(22～73岁)，活检前均未接受化疗、放疗等治疗并排除妊娠。所有患者同时接受HC-2的方法进行HPV DNA检测。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和保存

阴道镜下在活检获得组织病理同时，于宫颈病变部位活检获取组织一块，并置于-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 DNA提取、化学修饰及基因扩增

参照德国Qiagen公司试剂盒QIAamp DNA Mini Kit的说明进行DNA提取，参照Qiagen公司 EpiTect Bisulfite Kit的说明对DNA进行亚硫酸氢盐处理。LMX1A和PAX1基因转录调控区域的扩增采用巢式PCR。LMX1A基因扩增片段的外侧上游引物为：5’-TTTTTGAAAGTT GATTTGAAATG-3’；外侧下游引物为：5’-ACCCTCACCTACCCCAAATC-3’。PAX1基因扩增片段的外侧上游引物为：5’-AAGTTTATTTTGGGTTTGGGGT-3’；外侧下游引物为：5’-ACCCACCTCATCA ACCCTCCC-3’。用PyroMark Assay Design 2.0软件进行内侧引物设计，LMX1A基因所用上游引物：5’-TTGAAATGTATTTAAGAGTGAG-3’；下游引物R1：5’-AAAAAAACACTATAAAAAAC CC-3’。PAX1基因上游引物：5’-GTGGAGAG T G T T T T G G G A G G G-3’，下游引物：5’-AAATAACCRAAACTAAACCC-3’。对下游引物5’端进行生物素标记。

1.2.3 焦磷酸测序

按照PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪中甲基化分析要求进行测序。首先制备单链 DNA模板。然后进行焦磷酸测序反应。LMX1A基因所用测序引物为：5’-GGTTTTTGYGYGTATTTTA ATAGAG-3’，可测得6个CpG岛；PAX1基因所用测序引物为：5’-G G Y G G T A G G T T T T G G A G-3’，可测得9个CpG岛。在获得测序结果后，以每个基因所有检测位点的甲基化率的平均值来表示每份标本的该基因甲基化水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析。不同病变中LMX1A和PAX1基因的甲基化水平采用±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，2组间比较采用t检验。采用受试者工作特征曲线下面积(receiver operating characteristic curve，ROC)获得上述基因的甲基化定量分析用于诊断各级别宫颈病变的阈值及准确性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组患者临床资料的比较

121例患者按照组织病理被分为NLM组、LG-CIN组、HG-CIN组及ICC组。4组患者的平均年龄分别为36.2、38.3、39.7和44.4岁。ICC组患者的年龄明显高于其它3组患者(P<0.01)。经HC-2检测，4组患者高危型HPV的检测率分别为35.70%、81.20%、91.20%和92.60%(P<0.01)。

2.2宫颈组织LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

经焦硫酸测序技术，分别针对LMX1A基因的6个位点和PAX1基因的9个位点进行甲基化定量分析。用试剂盒提供的亚硫酸盐转化的通用DNA作为内对照，以检测标本中该位点的甲基化水平与内对照中该位点的甲基化水平的比值表示每一位点的甲基化率。某一标本中该基因所有位点的甲基化率的平均值定义为该标本中这一基因的甲基化水平。图1显示了1例低级别病变患者中PAX1基因9个位点的甲基化水平。

2.3 各组患者病变组织中LMX1A和PAX1基因甲基化水平的定量分析

表1比较了LMX1A基因和PAX1基因在4组患者中的甲基化水平。宫颈癌组的LMX1A基因甲基化平均水平为14.36%，HG-CIN组为4.70%，LG-CIN组为5.05%，NLM组为4.53%。对4组资料进行单因素方差分析，4组间差异有统计学意义(F=7.36，P<0.001)。4组之间两两比较，宫颈癌组与其它3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；而 NLM组、LG-CIN组和HG-CIN组之间差异无统计学意义(P>0.05)。PAX1基因的甲基化水平依次分别为41.97%、10.21%、5.55%和4.92%。对4组资料进行单因素方差分析，发现4组差异有统计意义(F=46.43， P<0.001)。4组之间两两相互比较，除NLM组和LG-CIN组之间差异无统计学意义外(P>0.05)，其它各组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。

图1 采用焦磷酸测序技术定量分析1例低级别上皮内瘤变中PAX1基因的甲基化Fig. 1 Detection of PAX1 gene methylation using the technique of pyrosequencing in a sample of LG-CIN

表1 不同宫颈病变组织中LMX1A和PAX1基因甲基化水平的比较Tab. 1 Comparison of LMX1A and PAX1 gene methylation in different cervical lesions

2.4LMX1A基因和PAX1基因甲基化水平诊断宫颈鳞癌的准确性分析

采用对宫颈组织中LMXA1基因甲基化水平的定量分析诊断宫颈鳞癌(宫颈鳞癌组及其它各组)的ROC曲线下面积(AUC)为0.603，灵敏度与特异度之和的最大值所对应的界定值为10.66% (灵敏度为37%，特异度为95%)，但与机会参考线下面积差异无统计学意义(P=0.104)。

采用对宫颈组织中PAX1基因甲基化水平的定量分析诊断宫颈鳞癌(宫颈鳞癌组及其它各组)的ROC曲线下面积(AUC)为0.883，显著大于机会参考线下面积(P<0.01)。灵敏度与特异度之和的最大值所对应的界定值为20.55%(灵敏度为81%，特异度为93%)。考虑临床恶性肿瘤筛查对于高灵敏度的要求，调整甲基化定量的实际界定值为9.58%时，PAX1基因甲基化的定量分析诊断宫颈鳞癌的灵敏度为89%，特异度为84%(图2)。

图2 PAX1基因甲基化水平的定量分析在诊断宫颈癌中的ROC曲线Fig. 2 The ROC curve for the diagnosis of invasive cervical cancer by the quantification of PAX1 gene methylation

3 讨 论

MSP是经典的检测基因甲基化的技术，该方法虽然简便有效，但结果判断需采用凝胶电泳，因此，如运用于人群筛查，需要投入大量的人力物力。且该方法只能做出甲基化和未甲基化的判断，无法对甲基化水平进行定量分析。焦硫酸测序技术在同一反应体系中经4种酶的协同作用，通过检测释放荧光的强度进行DNA的测序， 其优点在于高通量、快速、定量且结果直观［16］。该技术越来越多地被运用于基因甲基化的检测，并能对特定位点进行定量分析。

LMXIA是一种细胞发育过程中重要的转录因子，被认为是抑癌基因。LMX1A基因的甲基化可在肿瘤细胞株(HCT-116)检测到，而在DKO细胞株中去甲基化，这种去甲基化常受DNMT1和DNMT3b阻断［17］。在宫颈癌的形成过程中，LMX1A的蛋白表达从正常宫颈上皮到LG-CIN再到HG-CIN中的表达是上升的，但在发展为ICC和出现远处转移后表达明显下降［18］。启动子的甲基化是该基因表达失活的重要机制［13］。Lai等［13］采用MSP和亚硫酸测序技术发现89.9%的宫颈鳞状细胞癌组织存在LMX1A基因的高甲基化，明显高于正常组织。其后又采用实时定量甲基化特异PCR的方法发现ICC中该基因的甲基化比率(percentage of methylation ratio，PMR)明显高于原位癌、CINⅢ、CINⅡ及CINⅠ病变［19］。本研究采用焦硫酸测序的方法进一步证实了LMX1A基因的甲基化出现在宫颈上皮恶性转化并形成浸润的阶段，而在癌前期病变中较少见。因此，宫颈组织中该基因的甲基化检测可能在浸润癌和癌前期病变的鉴别中有价值。为了评估其临床运用价值，经ROC曲线下面积的计算其区分浸润癌和癌前期病变的最佳阈值定为10.66%，该阈值下的特异度为95%，但灵敏度较低，为37%， 因此，有必要联合其它基因检测以提高检测的准确性。

配对盒基因转录因子家族成员PAX1基因的表达失活见于宫颈癌中，并被认为和启动子的甲基化相关［13］。且PAX1基因甲基化可在宫颈癌患者的脱落细胞中被检测到［15］。在单中心研究中，Huang等［20］发现和HC-2的高危型HPV病毒检测相比，检测PAX1基因的甲基化指数在浸润性癌的鉴别中更为特异(84.7% vs 52.5%)，而在筛查CINⅢ以上病变中的特异度亦明显升高(93.3% vs 60.0%)。最近，台湾地区的一项包括11个中心的研究发现，采用多重定量PCR技术检测PAX1的甲基化指数筛查CINⅢ及以上病变的灵敏度和特异度分别为64%和91%［21］。Kan等［15］发现联合PAX1甲基化检测能够明显提高脱落细胞检测的准确性，并能使不必要的阴道镜检查和活检下降60%。以往我们采用MSP的方法已经发现PAX1基因的异常甲基化见于87.5%的子宫颈癌组织中，13.3%的 CINⅠ、46.7%的CINⅡ～Ⅲ病变中，差异有统计学意义(P<0.05)［7］。本研究进一步采用更为敏感而特异的定量分析方法。结果证实分析PAX1基因甲基化水平能有效鉴别ICC，ROC曲线下面积达0.883(P<0.001)。且在最佳阈值下，分析PAX1基因甲基化水平检测ICC的灵敏度达81%，优于传统的宫颈脱落细胞形态学检测。为了进一步提高临床检测的灵敏度，当PAX1基因甲基化水平界定值为9.58%时，其检测ICC的灵敏度为89%、但特异度下降至84%。进一步的研究将探讨PAX1基因甲基化水平检测联合传统宫颈脱落细胞学的检测效率。

综上所述，本研究结果表明LMX1A基因的甲基化定量分析的临床价值有限， 但定量分析宫颈组织中的PAX1基因的甲基化将有可能作为分子标志物用于ICC的鉴别中。

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Quantitative analysis of LMX1A and PAX1 gene methylation in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia

CHEN Wei1, YANG Huijuan1, XU Jun2, ZHU Haoping3(1.Department of Gynecologic Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Minhang Hospital, Fudan University, Shanghai 201199, China; 3.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China)

XU Jun E-mail: xujun1958@hotmail.com

Background and purpose:DNA methylation is a common epigenetic alteration in cervical carcinogenesis. The aim of this study was to measure the levels of LMX1A and PAX1 gene methylation in cervical cancer and precursors and to identify their potential in clinical application.Methods:Cervical specimens were collected from 121 female patients including 27 cases with invasive cervical cancers (ICC), 34 cases with high-grade cervical intraepithelial neoplasia (HG-CIN), 32 cases with low-grade cervical intraepithelial neoplasia (LG-CIN) and 28 cases with chronic cervicitis as normal controls (NLM). DNA methylations of the LMX1A and PAX1 gene were quantified using the techniques of nest PCR and pyrosequencing. The mean methylation values of the 6 gene loci on the LMX1A gene and the 9 gene loci on the PAX1 gene were respectively calculated for a given sample. Receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluatethe accuracy of gene methylation analysis to discriminate the cervical diseases.Results:The mean methylation value of the LMX1A gene in ICC was 14.36%, which was significantly higher than those in HG-CIN (4.70%), LG-CIN (5.05%) and NLM (4.53%) (P<0.01). The mean methylation value of the PAX1 gene in ICC was 41.97%, which was significantly higher than those in HG-CIN (10.21%), LG-CIN (5.55%) and NLM (4.92%) (P<0.01). The area under the ROC curve (AUC) was 0.603 for LMX1A gene methylation, and was 0.883 for PAX1 gene methylation, to discriminate ICC from HG-CIN, LGCIN, and NLM (P=0.104 and <0.001, respectively). The optimal cut-off value for PAX1 gene methylation was set at 20.50% with the sensitivity of 81% and with the specificity of 93%. If the cut-off value was set at 9.58%, the sensitivity and the specificity of PAX1 gene methylation were 89% and 84% respectively.Conclusion:Quantitative analysis of the PAX1 gene methylation in cervical tissue might be helpful to differentiate invasive cancers from precursors, while the clinical application of the LMX1A gene methylation was limited.

Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; DNA methylation; LMX1A gene; PAX1 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.004

R737.33

A

1007-3639(2015)01-0019-06

2014-10-09

2014-11-20）

上海市卫生局科研课题计划(20114152)。

徐军 E-mail:xujun1958@hotmail.com