氢化荧光素二乙酸酯的合成及其在活细胞染色中的应用

冯志明，冯 丹，熊灿娟，李旭红，曹小妹

(1.湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室，湖南长沙 410081;2.湖南省胸科医院，湖南 长沙 410006;3. 中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013)

1927年，Orndorff 等以荧光素和乙酸酐为原料制备了荧光素二乙酸酯(FDA)［1］。1964年，Ganesan 等人开始将FDA 用于动物细胞膜的研究［2］，此后逐步用于植物细胞染色［3］、测定花粉的生活力［4］和离体细胞活力检测［5，6］等研究，因此细胞的荧光素染色标记应用广泛。

荧光素二乙酸酯(FDA)是荧光素的二乙酸酯，亲脂性高于荧光素，易透过细胞膜被细胞所吸收。FDA 本身的荧光较弱，但进入细胞内的FDA 经脂酶水解成有荧光的荧光素，使细胞产生荧光，可用于研究细胞特性及细胞生长环境［7，8］。

本文拟通过锌粉和冰醋酸还原荧光素制备氢化荧光素，再经乙酸酐酰化合成氢化荧光素二乙酸酯(FHDA)，并探讨FHDA 用于活细胞染色标记的可行性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RE-52AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂(;倒置荧光显微镜IX71(奥林巴斯(。细胞株:HepG2 细胞(人的肝癌细胞、贴壁细胞)、U266 细胞(人的骨髓癌细胞、悬浮细胞)均为长沙赢润生物技术有限公司提供，其他试剂均为分析纯。

1.2 氢化荧光素二乙酸酯的合成

在三口烧瓶中加入15. 0 mL 甲醇和1. 66g(0.05 mol)荧光素，加热搅拌回流，待荧光素溶解后，加入8.0 mL 冰醋酸，控制反应温度在65℃左右。再把1.0 g 锌粉分五次加入，溶液颜色逐渐变淡至无色。趁热过滤除去未反应的锌粉，将滤液缓慢倒入冰水中，冷藏至析出白色絮状沉淀即为氢化荧光素粗品。粗品经硅胶(200 目)柱层析分离(乙酸乙酯-无水乙醇为洗脱液(。洗脱液真空浓缩至干，残渣用无水乙醇重结晶2 次，过滤后60℃真空干燥得1.08 g 氢化荧光素，收率约65%。

在三口烧瓶中加入0.88 g(0.025 mol)氢化荧光素和2.5 mL 乙酸酐，吡啶为催化剂，加热回流搅拌5h。冷却后过滤即得二氢荧光素二乙酸酯粗品。粗品用无水乙醇重结晶2 次，60℃真空干燥得白色固体1.02 g，收率约92.3%［1］。

1.3 细胞荧光染色

用浓度分别为10 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L 的FDA 和FHDA 进行细胞染色，37℃5% CO2培养箱中孵育染色5 min 后加入培养基以终止标记，并洗涤3 次去除残余染料，开始计时。随后按照细胞的正常培养方法进行培养，2 h 后用荧光显微镜观察荧光强度的变化。

对于悬浮细胞，需离心弃去培养基后置于离心管，用PBS 洗涤3 次，再将标记液滴在载玻片上，取适量细胞悬浮液涂片，紫外光激发，荧光显微镜下观察并拍照。

对于贴壁细胞，需提前一天分出适量细胞于96孔板，待第二天贴壁后弃去培养基，用PBS 洗涤3次，再将标记液加入空板中，37℃5% CO2培养箱中孵育染色5 min 后加入培养基以终止标记，并洗涤3次去除残余染料，开始计时。随后即可按照细胞的正常培养方法进行培养，2 h 后用荧光显微镜观察荧光强度的变化并拍照。

2 结果

2.1 FHDA 的浓度对细胞染色的影响

不论是贴壁还是悬浮细胞，当浓度为0.5 mg/L孵育染色5 min 时，FHDA 可基本标记细胞，荧光较强但淬灭也快(图1);当浓度为1 mg/L 孵育染色5 min 时，可充分标记细胞，荧光强且淬灭速度比0.5 mg/L 的慢(图2);当浓度为10 mg/L 孵育染色5 min 时，也可充分标记细胞，但细胞荧光未见显著增强，相反使荧光背景增加，但淬灭速度最慢(图3)。

图1 FHDA(10 mg/L)标记U266 细胞

图2 FHDA(1 mg/L)标记U266 细胞

图3 FHDA(0.5 mg/L)标记U266 细胞

增加FHDA 的浓度和孵育染色时间有利于延长细胞的荧光持续时间，但背景也会相应增强;降低FHDA 浓度和孵育染色时间会使其减弱荧光强度，背景荧光也会相应降低。FHDA 标记U266 细胞的最佳浓度为1mg/L，孵育染色时间为5 min。

2.2 FHDA 与FDA 染色的对比

当浓度为1 mg/L 孵育染色5 min 时，FHDA 和FDA 均可充分标记HepG2 细胞。当浓度达10 mg/L 孵育染色5 min 时，也均可充分标记细胞，但FDA标记的HepG2 细胞荧光背景较高(图4)，细胞荧光强度测定误差较大，而FHDA 标记的HepG2 细胞荧光背景低(图5)，易于定量观测细胞的荧光强度。

图4 FDA(10 mg/L)标记HepG2 细胞

图5 FHDA(10 mg/L)标记HepG2 细胞

3 讨论

FDA 的荧光较弱，进入细胞的FDA 可被脂酶水解为荧光素。荧光素比较稳定，不易被分解，在490 nm 处有强吸收峰，荧光发射波长530 nm，细胞内适当浓度的荧光素荧光可持续24 ～48 h，利用这一特性可通过荧光分光光度法定量检测FDA 的水解速率和细胞的活性。早在1963年Kramer 和Guibault 就利用FDA 的水解反应来测定脂肪酶的活性［9］，直至1980年FDA 的水解反应才被用来检测微生物活性［10，11］。采用FDA 水解法也可用来检测胚胎细胞的活力［12］。在未受损的胚胎细胞中FDA在脂酶的作用下水解为荧光素，继而在细胞内积聚;细胞的荧光强度与活细胞脂酶的活性物质代谢强度成正比。只要胚胎不破坏，极性荧光素不会很快地从细胞中重新脱离出来。相反，如果细胞膜受损破坏时，芡光素就从细胞中脱离并返回扩散到培养液中。因此细胞内荧光显示了细胞膜的完整性，以此可作为胚胎细胞生活力的指示剂［13］。

进入细胞的FDA 可被脂酶水解为荧光素，主要用于探测细胞脂酶活性。但细胞外水溶液中的FDA 也不稳定，易水解为有荧光的荧光素，因而背景较高，不易定量检测［14］，从而制约了其进一步发展。

FHDA 本身没有荧光，是一可溶性小分子，可通过自由扩散透过细胞膜(包括线粒体膜)。进入细胞的FHDA 在脂酶的作用下水解为氢化荧光素。氢化荧光素也没有荧光，不能自由进出细胞，但它对细胞内的过氧化氢、脂质过氧化物和氧自由基等活性氧敏感，可被其氧化成有荧光的荧光素。细胞的荧光强度除与细胞内脂酶的活性有关外，主要与细胞内的活性氧成正比，因此可用来定性、定量探测细胞活性氧浓度，也可用于药物的筛选和毒理学等研究［15］。

由于FHDA 及其的水解产物—氢化荧光素都没有荧光，因此FHDA 作为细胞的荧光探针，其背景更低，易于观测(图5)。尽管2(，7(-二氯氢化荧光素(DCFH-DA)也可用于测定过氧化氢、活性氧和一氧化氮等细胞活性物质［16，17］，但DCFH-DA 价格昂贵，制造成本较高，而FHDA 合成与纯化简便，价廉易得，因此FHDA 作为细胞酯酶和活性氧等活性物质的探针仍值得研究与推广。

［1］Orndorff WR，Hemmer A. Fluorescein and Some of Its Derivatives［J］. J Am Chem Soc，1927，49(5):1272-1280.

［2］Ganesan AK，Ratman B. Expression of newly transferred genes controlling β-d-galactosidase synthesis in Escherichia coli［J］. J Mol Biol，964，10:337-340.

［3］Saruyama N，Sakakura Y，Asano T，et al. Quantification of metabolic activity of cultured plant cells by vital staining with fluorescein diacetate［J］. Anal Biochem，2013，441(1):58-62.

［4］王锋，陈容茂，邵小华. 应用FDA 法检查枇杷品种花粉生活力［J］.福建农业科技，1992，3:20.

［5］张峰，祁岩超，卢发根，等.离体胎大脑皮质细胞存活时间的观察［J］.中华器官移植杂志，1994，15(3):98-99.

［6］Gray DW，Morris PJ. The use of fluorescein diacetate and ethidium bromide as a viability stain for isolated islets of Langerhans［J］. Stain Technol，1987，62(6):373-381.

［7］Patel BCM，Courtney JM，Evans JH，et al. Biocompatibility Assessment:Application of Fluorescent Probe Response(FPR)Technique［J］.Biomaterials，1991，12:722-726.

［8］Bissell DM. Study of hepatocyte function in cell culture［J］. Prog Liver Dis，1976，5:69-82.

［9］Kramer DN，Guilbault GG. A substrate for the fluorimetric determination of lipase activity［J］. Anal Chem，1963，35:588-～589.

［10］Swisher R，Carroll GC. Fluorescein diacetate hydrolys is as an estimator of microbial biomass on coniferous needle surfaces［J］. M icrobial Ecology，1980，6(3):217-226.

［11］Schnürer J，Rosswall T.Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of total microbial activity in soil and litter［J］. Appl Environ Microbiol，1982，43(6):1256-1261.

［12］窦忠英.小鼠胚胎冷冻保存试验［J］.西北农业大学学报.1986，14(4):7-12.

［13］Brouwer N，Kohen J，Jamie J，et al. Modification of the fluorescein diacetate assay for screening of antifungal agents against Candida albicans:comparison with the NCCLS methods［J］. J Microbiol Methods，2006，66(2):234-241.

［14］Clarke JM，Gillings MR，Altavilla N. Potential problems with fluorescein diacetate assays of cell viability when testing natural products for antimicrobial activity［J］. J Microbiol Methods，2001，46(3):261-267.

［15］Chand S，Lusunzi I，Veal DA，et al. Rapid screening of the antimicrobial activity of extracts and natural products［J］. J Antibiot (Tokyo).1994，47(11):1295-1304.

［16］葛凤燕，陈立功.2'，7'-二氯-5(6)-羧基荧光素的合成及其荧光性能研究［J］.化学通报，2009，72(1):78-81.

［17］Aranda A，Sequedo L，Tolosa L，et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA)assay:a quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells［J］.Toxicol In Vitro，2013，27(2):954-963.